絲素蛋白人工神經導管的皮膚致敏實驗

嚴小莉 趙亞紅 趙微加 楊宇民

絲素蛋白人工神經導管的皮膚致敏實驗

嚴小莉 趙亞紅 趙微加 楊宇民

目的評價本實驗室自制的絲素蛋白人工神經導管對皮膚潛在的致敏性。方法以ISO 10993-10:1995標準，采用最大劑量法，將白化豚鼠分為SF-NGC組、陽性對照(甲醛溶液)、陰性對照(生理鹽水)3組，先進行預試驗確定主試驗各階段的濃度，然后進行主試驗。在激發階段的敷貼物去除后24 h、48 h、72 h，觀察記錄各組動物激發部位的皮膚情況，按標準進行評分，并算出致敏率。結果絲素蛋白人工神經導管的皮膚反應記分為0，致敏率為0。結論在試驗條件下絲素蛋白人工神經導管無潛在的皮膚致敏性。

絲素蛋白人工神經導管生物相容性皮膚致敏試驗

蠶絲，是最早被利用的動物蛋白質之一。由于具有良好的力學性能，其作為生物材料的應用也具有悠久歷史，尤其是來自Bombyx mori蠶屬的蠶絲早在100多年前就被編織成手術縫線[1]。最近，蠶絲的核心蛋白——絲素，在生物醫學方面的應用正在被不斷開發，尤其是近年來廣泛地應用于組織工程學方面的研究[2-3]。本實驗室成功自制了絲素蛋白人工神經導管，并對其生物相容性及其對大鼠坐骨神經的修復功能進行了一系列研究[4-5]。本研究以ISO 10993-10:1995標準，對本實驗室自制的絲素蛋白人工神經導管的潛在致敏作用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

弗氏完全佐劑（Sigma公司）；十二烷基硫酸鈉（AR，上海生化試劑有限公司）；多聚甲醛（AR，國藥集團試劑有限公司）；絲素蛋白人工神經導管（本實驗室自制）。

1.1.2 實驗動物

健康的初成年白化豚鼠，體重為300～500 g，雌雄不限，雌鼠為未產并無孕（南京市江寧區青龍山動物繁殖場）?？倲盗繛?0只，其中14只用于確定皮內誘導的濃度，21只用于確定局部誘導和局部激發的濃度，45只用于主試驗。

1.1.3 實驗分組

共3組，分別是SF-NGC(絲素蛋白人工神經導管)組、陽性對照組、陰性對照組。規格為：內徑1.8 mm，外徑4 mm。陽性對照為甲醛溶液，陰性對照為生理鹽水。

1.1.4 材料浸提液的制備

絲素蛋白人工神經導管經過121℃高壓滅菌20 min，將材料分別以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標準浸入生理鹽水，在培養箱中(37±1)℃條件下靜置(72±0.5)h，制成高、中、低3種劑量的浸提液，并于12 h內用于試驗。陽性對照：甲醛配制成濃度為6%、5%、4%（w/v）的水溶液。

1.2 方法

1.2.1 確定主試驗皮內誘導階段的濃度

將SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標準制浸提液，每種濃度的浸提液在動物去毛的肩胛骨內側成對進行皮內注射，每點注射0.1 mL。每種濃度用2只豚鼠。6%、5%、4%（w/v）的甲醛水溶液3種濃度同法進行試驗。觀察各動物的局部及全身情況。主試驗皮內誘導階段所選擇的最高濃度，以不導致皮膚大面積損傷及對動物產生其它有害作用為標準。2只動物皮內注射生理鹽水作陰性對照。

1.2.2 確定主試驗局部誘導階段和局部激發階段的濃度

將SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標準制浸提液，分別浸透濾紙片后貼敷于動物去毛的腹側部，用封閉式包扎帶包扎固定。每種濃度用3只豚鼠。24 h后除去包扎帶和濾紙片。6%、5%、4%（w/v）的甲醛水溶液3種濃度同法進行試驗。3只動物用生理鹽水同法進行試驗作為陰性對照。在可能的情況下，以可導致動物輕度紅斑，但不對動物產生其他有害作用的濃度為主試驗局部誘導階段的濃度。選擇不產生紅斑反應的濃度為主試驗局部激發階段的濃度（表1）。

表1 各組在主試驗各階段的濃度

1.2.3 主試驗

第1天，提取白化豚鼠45只，分成3組，每組15只，開始適應環境。第7天，在胸廓的背前區備皮4 cm×6 cm。

第8天，在每只動物去毛的肩胛骨內側部位成對皮內注射0.1 mL。其中靠近頭部的2點注射弗氏完全佐劑與生理鹽水的等體積混合液；中間2點注射預試驗時表l確定的濃度的浸提液，陰性對照組則注射生理鹽水；靠近尾部的2點注射前2種注射液的等體積混合物。

局部誘導階段7 d的觀察發現，除陽性對照組外，其余各組均未產生刺激反應。遂在局部誘導斑貼前(24±2)h(即第14天)，在未產生刺激反應的豚鼠的試驗區用10%十二烷基硫酸鈉石蠟液預處理，按摩導入皮膚。第15天，各組分別用表1選定的濃度，將20 mm×40 mm濾紙浸透后貼敷于每只動物的肩胛骨內側部位誘導注射點。封閉式包扎帶包扎固定。(48±2)h后去除包扎帶和濾紙片。對照組動物使用溶劑同法操作。

第28天，動物的單側腹部用電動剃刀剃刮毛發4 cm×6 cm范圍。第29天，用表l選定的激發階段的濃度，浸透濾紙片，貼敷于每只豚鼠的單側腹部。封閉式包扎帶包扎固定。(24±2)h后去除包扎帶和濾紙片。

除去敷貼后24 h、48 h、72 h觀察試驗組和對照組動物激發部位的皮膚情況。按如下評分標準評價紅斑和水腫反應程度：無紅斑：0分；極輕微紅斑：1分；紅斑清晰：2分；中度紅斑：3分；重度紅斑至輕微焦痂形成：4分。無水腫：0分；極輕微水腫：1分；水腫清晰：2分；中度水腫：3分；重度水腫：4分。

2 實驗結果

2.1 動物活體觀察

各組動物活動正常，飲食正常，敷料包扎固定良好，無移位。

SF-NGC組：各動物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的觀察結果都是無紅斑、無水腫。

陽性對照組：各動物在去除敷料后24 h均為中度紅斑至輕度結痂形成，中度水腫；48 h為中度紅斑至輕度結痂形成，水腫清晰；72 h為中度紅斑至輕度結痂形成，極輕微水腫。

陰性對照組：各動物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的觀察結果都是無紅斑、無水腫。

2.2 各組皮膚反應記分結果

按ISO 10993—10:1995的皮膚反應分類系統對各組皮膚反應記分結果見表2。結果顯示陽性對照甲醛溶液的致敏率為100%，皮膚反應平均記分為6，表明它具有致敏性。

SF-NGC組與陰性對照組的皮膚致敏反應平均記分均為0，致敏率為0，表明本實驗室自制的絲素蛋白人工神經導管在試驗條件下對皮膚無潛在致敏性。

表2 各組皮膚致敏率和皮膚反應記分

3 討論

當外周神經受到長距離損傷時，必須要有合適的橋接物連接兩斷端。從而使近端神經沿著正確的方向生長，選擇合適的橋接物成為目前神經科學及材料科學共同關注的焦點[6]。過去曾研究以自體或異體的組織作為橋接物，但存在很多困難，如供體缺乏、免疫排斥反應等[7]。因此，尋找一種合適的人工組織材料作為橋接物成為目前神經再生研究的關鍵之一。

絲素蛋白具有良好的生物力學性能；有一定的可降解性，且降解產物主要為游離氨基酸等[8]；與背根神經節[9]及海馬神經元[10]都有較好的生物相容性。因而，本實驗室構建了絲素蛋白神經導管，用于神經損傷修復的研究。

依據醫療器械生物學評價標準，醫用材料需進行生物學評價，根據不同的臨床應用，選擇不同的生物相容性試驗。皮膚致敏試驗是絲素蛋白神經導管必須要進行的生物學評價之一。采用豚鼠測試皮膚致敏的方法有多種，最常用的兩種方法是最大劑量法（Magnusson&Kligman）和封閉斑貼法（Buehler），只需采用其中一種方法即可。最大劑量法為最敏感和首選的方法。本試驗以ISO 10993-10:1995標準，采用最大劑量法。評估得出：絲素蛋白神經導管在試驗條件下無潛在致敏性。當然，動物實驗對于材料的致敏性檢測只是初步的評價，確切的結論還需結合人體的臨床應用情況。

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[2]Altman GH,Horan RL,Lu HH,et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments[J].Biomaterials,2002,23(20):4131-4141.

[3]Altman GH,Diaz F,Jakuba C,et al.Silk-based biomaterials[J]. Biomaterials,2003,24(3):401-416.

[4]Chen X,Yang Y,Wu J,et al.Biocompatibility studies of silk fibroin -based artificial nerve grafts in vitro and in vivo[J].Prog Nat Sci, 2007,17(9):1029-1034.

[5]Yang Y,Ding F,Wu J,et al.Development and evaluation of silk fibroin-based nerve grafts used for peripheral nerve regeneration [J].Biomaterials,2007,28(26):5526-5535.

[6]Ichihara S,Inada Y,Nakamura T.Artificial nerve tubes and their application for repair of peripheral nerve injury:an update of current concepts[J].Injury,2008,4:29-39.

[7]Ciardelli G,Chiono V.Materials for peripheral nerve regeneration [J].Macromol Biosci,2006,6(1):13-26.

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[9]陳雪梅,楊宇民,王鴻逵,等.絲素纖維與背根神經節體外生物相容性初步研究[J].交通醫學,2006,20(5):489-491.

[10]湯欣,楊宇民,丁斐,等.絲素纖維與海馬神經元的生物相容性細胞培養研究[J].交通醫學,2006,20(5):491-493.

Skin Sensitization Test of Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit

YAN Xiaoli,ZHAO Yahong,ZHAO Weijia, YANG Yumin.
Jiangsu Key Laboratory of neuroregeneration,Nantong University,Nangtong 226001,China.

ObjectiveTo study the sensitization of silk fibroin-based nerve guidance conduits（SF-NGCs）in vitro. MethodsAccording to ISO 10993－10:1995 standard,maximization test was conducted in guinea pig.The skin sensitization reactions,including erythema and oedema,induced by SF-NGCs,normal saline and formalin solution were observed and scored respectively at 24,48 and 72 h exposure of the infusion of the materials.The allergenic rates and mean response score were calculated.ResultsThe allergenic rates and score of skin reaction of SF-NGC was 0/15 and 0,those of norm al saline 0/15 and 0.The group of normal saline was 0/15 and 0,but the group of formalin solution was 15/15 and 5. ConclusionSF-NGC is safe without skin sensitization.

Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit;Biocompatibility;Skin Sensitization Test

R392-33

A

1673－0364（2009）－01－0029－03

2008年11月30日；

2009年2月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.008

國家自然科學基金（30770585），國家教育部“新世紀優秀人才支持”項目（NCET-07-0466），江蘇省高校自然科學重大基礎研究項目（07KJA31025）。

226001江蘇省南通市南通大學神經再生重點實驗室。

楊宇民。