去抗原異種松質骨材料的生物相容性研究

王德超 李 奎 崔冰寧 宇程峰

去抗原異種松質骨材料的生物相容性研究

王德超 李 奎 崔冰寧 宇程峰

目的研究去抗原異種松質骨支架材料的生物相容性，為其在骨缺損修復領域中的臨床應用提供實驗依據。方法對去抗原異種松質骨支架材料進行急性毒性實驗、熱源實驗、溶血實驗、凝血實驗、兔肌肉內種植實驗和兔橈骨骨缺損修復實驗研究。結果去抗原異種松質骨支架材料無毒性、無熱源性、不引起溶血和凝血反應，植入兔肌肉后逐漸發生生物降解并被纖維組織取代，兔骨缺損區植入后可被骨組織取代。結論去抗原異種松質骨支架材料具有良好的生物相容性，是理想的骨支架材料。

骨修復材料去抗原異種松質骨生物相容性組織工程

目前，治療骨缺損的較理想方法是自體骨移植，但自體骨的來源困難，尤其是長骨缺損，是臨床上亟待解決的難題之一。組織工程是應用生命科學和工程學的原理與技術，尤其是在細胞生物學原理基礎上，充分利用現代生物材料,以修復和替代損傷的組織器官。研制理想的生物材料替代自體骨移植用于修復骨組織缺損，是醫學和生物材料科學領域的一個重要課題。臨床上已應用的骨移植物較多，如無機骨、羥基磷灰石、脫鈣骨、脫蛋白骨以及各種各樣的人工復合材料等，為臨床骨缺損的治療提供了很多選擇。但是這些方法各有不足，難以滿足臨床上修復各種骨缺損的需要。異種骨來源廣泛，取材方便。去抗原異種松質骨具有天然的多孔結構，形狀規則，具有可塑性及一定的機械強度，容易加工成所需的形狀并有支撐作用。去抗原豬松質骨支架材料作為骨組織工程支架的一種，具有良好的力學性質、空間結構、降解性、骨傳導性、成骨誘導性等特點，日益受到重視，但其生物相容性尚未見報道。本研究對去抗原豬松質骨的生物相容性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

去抗原豬松質骨材料制備：取新鮮豬股骨，去除軟組織和骨髓后，鋸成20 mm×10 mm×10 mm骨塊，依次經過20%H2O2浸泡8 h；1:1甲醇/氯仿浸泡12 h；0.5%Triton X-100浸泡10 h；0.1%胰蛋白酶溶液（pH 7.8）中浸泡處理8 h；10%高滲鹽水浸泡8 h；蒸餾水沖洗浸泡l2 h；50℃以下烘干；包封后60Co照射(20 KGy)36 h備用。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗

選健康小鼠10只，體重20～24 g，雌雄各半，隨機分成2組，每組5只。將塊狀的豬去細胞骨在37℃水浴箱中用生理鹽水持續浸泡24 h(材料重量與浸提介質容量的比例為0.1 g/mL)，制備材料浸提液，過濾除菌。實驗組無菌條件下向每只小鼠腹腔內注入1 mL浸提液，對照組單純注入等量生理鹽水。觀察72 h，主要觀察記錄動物神經系統、呼吸、步態、活動等不良反應癥狀及有無死亡。然后取心、肺、肝、脾、腎標本作常規組織學觀察。

1.2.2 熱源試驗

用與急性毒性試驗相同的方法制備和消毒去抗原豬松質骨浸提液。選健康4月齡新西蘭白兔3只，體重2～2.5 Kg，飼養條件一致，氯胺酮+異丙嗪麻醉，測量肛溫兩次，間隔1 h，取平均值為正常體溫。試驗材料研成細粉末，按1 g/10mL比例制成生理鹽水浸提液，過濾除菌。向每只兔耳緣靜脈注入5 mL浸提液，注射后每隔1 h測量兔體溫1次，共3次，以3次體溫中的最高值減去正常體溫，即為該兔的體溫升高值。

1.2.3 溶血試驗

取新鮮兔血用生理鹽水釋成2%兔血懸液，將材料浸提液、生理鹽水（陰性對照）和雙蒸水（陽性對照）各2 mL、試驗材料2 g分別加入2%兔血懸液2 mL，每組各3份。37℃水浴1 h，肉眼觀察有無溶血，隨即離心，取上清液1 mL，在722型分光光度計于545 nm處測定吸光度值，計算溶血率。

1.2.4 凝血試驗

取材料50 mg、100 mg、200 mg分別加入正常混合血漿中，用自動血液凝固儀于1 h內測定凝血酶原時間(PT)、部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶凝固時間(TT)和纖維蛋白原，觀察材料對凝血功能的影響。

1.2.5 肌肉、骨內長期植入試驗

取健康家兔15只，體重2.0～2.5 Kg，無菌條件下在距股骨髁關節面8～10 mm松質骨處作經髁橫形截骨，復位后在髁間凹中心鉆孔，插入一枚HA/PDLLA棒材固定，另取2 mm×2 mm×12 mm HA/PDLLA試件植入雙側骶棘肌內，術后動物自由活動，不用外固定。進行以下觀察：于8周、16周、24周各處死5只動物，作X線攝片后取股骨遠端、材料周圍肌肉組織作常規組織學觀察。

2 結果

2.1 急性毒性試驗

動物一般情況良好，活動、食欲正常，呼吸平穩，無驚厥、癱瘓和死亡現象，心、肺、肝、脾、腎標本組織學觀察未見組織和細胞的變性及壞死。按WHO化學物質急性毒性試驗標準，說明材料按毒性分級屬于無毒級。

2.2 熱源試驗

3只家兔體溫升高均低于0.6℃，升高總值0.86℃，低于1.4℃的標準。材料浸提液熱源檢查符合規定標準。

2.3 溶血試驗

實驗組和生理鹽水陰性對照組均無溶血現象，雙蒸水陽性對照組全部溶血。實驗組溶血率為1.9%，小于5%，說明該材料具有良好的血液相容性。

2.4 凝血試驗

加入不同劑量顆粒樣品后，血漿中4項指標均正常，說明材料對凝血功能無影響。

2.5 肌肉、骨內長期植入試驗

去抗原豬松質骨在肌肉植入實驗中，有溶解現象，包膜未增厚，未見多核巨細胞。骨內長期植入實驗X線攝片見6周時骨折愈合，無畸形。材料在12周前可清晰顯影。組織學觀察3周時骨折端有明顯骨痂生成，材料在髁部與骨組織直接接觸，在髓腔中材料周圍有明顯新骨生成，無中性粒細胞、淋巴細胞聚集，偶見巨噬細胞。6周時骨折均愈合，炎性細胞減少。

3 討論

骨缺損的修復是骨科的難題之一，國內外學者都在研究骨的替代材料以解決這個難題。骨組織工程概念出現后，引起廣大學者的關注。骨組織工程學研究中，種子細胞及細胞載體的選擇是極其重要的問題。其中生物材料具有不可替代的作用，它能為細胞的黏附、分化和增殖提供良好的三維空間。因此，理想的生物材料應具有良好的生物相容性、骨傳導性、一定的骨誘導性、一定的抗負荷能力、可生物降解、有利于細胞貼附和血管長入，對細胞、組織等應無毒性、無刺激性、無致畸突性，有可加工性及可消毒性。異種松質骨具有天然密集孔，大小較均勻，孔的直徑更接近天然孔；隨著免疫學、生物化學的發展，經一系列化學處理后，其中的免疫原性成分基本上被去除，故一般不會引起排斥反應。

理想的骨組織工程細胞外基質材料應具有良好的生物相容性和可降解性，合適的三維多孔結構，較強的骨誘導性，良好的可塑性和適當的機械強度，尤其是作為管狀骨的修復材料[1-2]。由于創傷、腫瘤、炎癥等造成的大范圍骨缺損是骨科難題之一。目前骨移植手術是最為常用且行之有效的方法。提供移植的材料多種多樣，但理想的骨缺損修復材料，尤其是修復大段骨缺損的移植材料仍是骨科面臨的重要課題。異種骨由于來源廣泛和經濟簡便，在解剖形狀、組織結構等方面具有無法比擬的優越性，一直是相關學者熱衷于研制、改良、開發的植骨材料。然而，異種骨的免疫排斥反應妨礙植骨與骨缺損區域直接接觸，破壞植骨成分，造成局部炎癥反應，導致植骨吸收。

在消除異種骨的抗原性的同時，保留其誘導成骨能力，是人們所期望的。骨是一種復合組織，除骨細胞和骨基質之外，還有血管、神經、脂肪及殘留的骨髓成分等，這些成分均具有免疫原性。劉瑋等[3]用現代免疫組織化學方法結合新鮮不脫鈣切片技術首先證實：皮質骨抗原性主要位于骨細胞和哈佛管內皮上，免疫酶染色棕色酶反應物主要集中在骨細胞周邊和中央管周圍基質上，推測抗原可能位于細胞膜上。羅卓荊等[4]通過對松質骨抗原性的研究發現，在骨小梁骨基質染色陰性，而骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞及骨陷窩等均有不同程度的陽性染色。細胞陽性染色的部位主要在胞漿中。也就是說，各種細胞成分仍是松質骨中抗原的主要成分。常用的去細胞方法有酶消化法、滲透溶液法和去污清洗法。異種骨經過脫蛋白、脫脂及脫細胞處理后抗原性降低，同時保留其特有的天然網狀結構和骨礦支架，且與人的骨組織結構具有同源性，無機成分主要是羥基磷灰石，與人骨相同，具有較好的生物相容性。在具體制作工藝中，異種骨處理的無機與有機成分比至關重要。異種骨有機成分中很多非膠原的酸溶性蛋白具有免疫原性，去除不充分則保留較強抗原性，但去除過多膠原蛋白則材料易碎，影響生物力學強度。我們在總結以往制備工藝的基礎上，盡量保留膠原纖維，去除非膠原蛋白、肽類及脂類、細胞等，以降低抗原性，同時保留力學強度。H2O2可消除非膠原蛋白，氯仿、甲醇去脂，除垢劑Triton X-100是非離子性除垢劑，同蛋白酶及高滲鹽水一道具有脫細胞作用。Triton X-100屬于非離子型表面活性劑，在溶液中穩定性強，能與細胞膜中的磷脂結合形成復合物，溶解于溶液中，同時其疏水端能和膜蛋白結合破壞細胞膜。高滲生理鹽水是借助細胞內外滲透壓的差別，致使細胞膜破壞，細胞從基質中分離，從而獲得去細胞基質。蛋白酶用酶的消化破壞細胞膜和細胞器，細胞與基質分離，從而達到脫細胞目的。

生物相容性是指材料與機體之間相互作用產生各種復雜的生物、物理、化學反應，以及機體對這些反應的忍受程度。目前對生物材料的相容性評價方法主要有兩類，一是動物體內實驗，即將材料植入體內做組織學檢查，觀察材料及周圍組織病理變化；另一類為體外試驗，即用材料或浸提液研究材料對組織生長、代謝及增殖方面的影響。目前國內外尚沒有形成統一的標準和方案，我們主要參考《生物材料和醫療器材生物學評價技術要求》[5]，選用了6個實驗對研制的去細胞基質骨的生物相容性進行評價。本研究通過對去抗原豬松質骨進行急性毒性實驗、溶血反應、凝血反應和熱源實驗檢測發現該材料無毒性、無熱源性、不引起溶血和凝血反應。本實驗中，肌肉和骨長期植入試驗動物傷口Ⅰ期愈合，無感染和竇道形成，組織學觀察見骨折正常愈合，無抑制現象，組織反應溫和，未見大量炎性細胞、巨噬細胞和多核巨細胞集聚，證明材料無毒性、無刺激性和致突變性，不會引起溶血或凝血，生物相容性好。從本實驗結果分析，可以初步認為，自行制備的去抗原異種松質骨材料無毒性作用，具有良好的生物相容性，可望成為一種較理想的骨移植替代材料。

[1]Griffith LG.Emerging design principles in biomaterials and scaffolds for tissue engineering[J].Ann NY Acad Sci,2002,961:83-95.

[2]Chu TM,Holister SJ,Halloran JW,et al.Manufacturing and characterization of 3-D hydroxyapatite bone tissue engineering scaffolds[J].Ann NY Acad Sci,2002,961:114-117.

[3]劉瑋,陸裕樸,胡蘊玉,等.異種植骨抗原性的免疫組織化學實驗研究[J].中華骨科雜志,1989,9(1):53.

[4]羅卓荊,胡蘊玉,王茜,等.異種松質骨移植抗原分布的免疫組化研究[J].中國矯形外科雜志,1998,5(6):539-540.

[5]衛生部藥政管理局.生物材料和醫療器材生物學評價技術要求[M].1997,1-44.

The Biocompatibility Study of Antigen-Extracted Xenogeneic Cancellous Bone Matrix

WANG Dechao,LI Kui,CUI Bing,NING Yu,CHENG Feng.
Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College,Luohe 462000,China.

ObjectiveTo study the biocompatibility of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix for the clinical use in the bone reconstruction field.MethodsAcute toxicity test,pyrogen test,hemolysis test,hemopexis test,and long-term muscle and bone implant reaction were included in this study to evaluate the biocompatibility of antique-extrated xenogenetic cancellous bone matrix.ResultsAll results indicated that the material had no toxicity,and it did not cause hemolysis and hemopexis.The material is safe without pyrogen.It could be biodegradated and replaced by fibrous after implanting into muscle.It also could be replaced by bone tissue after implanting into bone defects in rabbits.Conclusion Antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix has good biocompatibility.It is a kind of ideal scaffold material.

Bone repair material;Antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix;Biocompatibility; Tissue engineering

R392-33

A

1673－0364（2009）－01－0032－03

2008年8月22日；

2008年11月16日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.009

462000河南省漯河市漯河醫學高等專科學校第二附屬醫院骨五科。