自體骨髓基質干細胞組織工程骨修復顱骨缺損的臨床研究

王有剛 李新慶 李春和 吳智遠 崔磊 劉廣鵬 李宇琳 孫劍

自體骨髓基質干細胞組織工程骨修復顱骨缺損的臨床研究

王有剛 李新慶 李春和 吳智遠 崔磊 劉廣鵬 李宇琳 孫劍

目的探討人骨髓基質干細胞（hBMSCs）作為種子細胞的組織工程骨修復外傷后顱骨缺損的可行性。方法自2006年6月至2007年2月，共4例外傷后顱骨缺損患者，抽取患者骨髓，分離得到hBMSCs，體外擴增和成骨誘導后，將hBMSCs與部分脫鈣骨復合，體外共培養1周后，手術植入顱骨缺損區。分別于術后1周和3個月、6個月進行臨床和三維CT檢查隨訪。結果術后1周，三維CT均顯示骨缺損區被所植入的組織工程骨充填；術后3～6個月，CT顯示組織工程骨形成并修復骨缺損，新生骨與骨缺損斷端融合。高齡患者及骨缺損面積過大患者，組織工程骨體內成活率較差。結論通過選擇適宜的病例，以自體hBMSCs作為種子細胞，運用組織工程技術可以在人體內形成穩定的組織工程骨并可用于修復顱骨缺損。

骨髓基質干細胞組織工程顱骨缺損臨床應用

外傷性顱骨缺損臨床較常見，目前多用人造材料或自體骨移植進行修復。人造材料存在免疫排斥反應，而自體骨組織移植則存在供區有限等問題[1-5]。近年來，組織工程技術的迅猛發展，為臨床顱骨缺損修復提供了新的思路。我們于2006年6月至2007年 2月，以經體外成骨誘導的自體人骨髓基質干細胞（Human bone marrow stromal cells,hBMSCs）為種子細胞、部分脫鈣骨（Partly demineralized bone matrix, pDBM）為支架材料，對4例外傷后顱骨缺損患者進行修復，取得了較理想的療效。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本組共4例，男、女各2例。年齡最小8歲，最大50歲。4例患者均為外傷性顱骨缺損，缺損面積最小為3 cm×4.5 cm，最大7 cm×8 cm，其中1例為2處缺損。缺損部位分別位于右顳枕部、右額顳部、額部。病程3～15個月不等。所有患者術前均行三維CT檢查。

1.2 方法

1.2.1 組織工程骨的體外培養

1.2.1.1 自體hBMSCs的體外培養和成骨誘導

從患者骼后上棘經穿刺抽取骨髓10～20 mL，將獲取的骨髓置于Percoll分離液上（密度1.073 g/L，Pharmacia公司，美國），骨髓與分離液的比例為1∶2，2 550 r/min離心30 min，吸取中間云霧狀細胞層，以2×107cell/cm2的密度接種于培養皿，進行體外細胞擴增，以成骨條件培養液（DMEM，10 mmol/Lβ-磷酸甘油鈉，10～8 mol/L地塞米松，50μmol/L磷酸抗壞血酸，300 mg/L谷氨酞胺和10%胎牛血清）進行成骨誘導培養。原代細胞接種后48 h換液，達80%～90%融合后，采用0.25%胰酶消化，以2×103cells/cm2的密度進行傳代培養，取第3代細胞用于成骨檢測，并接種于部分脫鈣骨材料。

1.2.1.2 成骨誘導后hBMSCs的成骨表型鑒定

倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，按參考文獻[1]的方法，行第3代細胞爬片鈣結節四環素熒光染色。

1.2.1.3 hBMSCs復合pDBM體外培養

pDBM由上海組織工程研究與開發中心制備，孔隙率80%～85%，脫鈣程度約為30%～35%[6]。成骨誘導后的hBMSCs以3.5×107cells/mL的濃度接種于pDBM（其規格大小按患者術前三維CT檢測結果，參照正常側來確定骨缺損范圍)[4]，體外繼續成骨培養1周，鏡下觀察細胞在pDBM上生長情況。回植前2 d，換用無血清培養液培養[2]。

1.2.2 手術方法

手術均在全麻下進行。按神經外科常規開顱手術方法，暴露骨缺損區，徹底止血，然后將細胞材料復合物拼接，并完全覆蓋顱骨缺損區，使細胞材料復合物邊緣和周圍正常骨密切接觸，用可吸收縫線將細胞材料復合物與周圍骨組織固定后，頭皮下置負壓引流，嚴密縫合軟組織，關閉創面。術后使用抗生素3～5 d。

1.2.3 組織工程骨體內成骨的評價

分別于術后1周和3個月、6個月進行臨床（術前、術后照片）對比和三維CT檢查隨訪，對治療效果進行近、中期評價。

2 結果

2.1 hBMSCs的體外形態觀察和生長規律

原代細胞接種24 h后，倒置顯微鏡觀察可見hBMSCs貼壁，呈紡綞形，核大，核仁清晰，以集落樣方式生長。10～14 d后細胞已大部分融合，并且細胞體積逐漸增大，向多角形轉變。全部患者均分離得到自體hBMSCs，經體外成骨誘導并擴增至第3代，平均擴增（163±13）倍，與文獻報道相符[3]。

2.2 hBMSCs成骨表型的鑒定

經成骨誘導培養后，hBMSCs有鈣結節沉著且熒光染色陽性。

2.3 細胞材料復合物體外共培養

倒置顯微鏡下觀察,pDBM有良好的細胞相容性，hBMSCs接種于pDBM后3～4 h可見hBMSCs貼附生長，細胞在pDBM孔隙中粘附良好；5～8 d可見細胞及其分泌的細胞外基質充滿pDBM孔隙。

2.4 臨床治療結果

術后早期，2例患兒出現頭皮下積液，其中1例患兒術后5 d于左額部（非手術區）頭皮下抽出血性積液10 mL后未再出現積液；另1例術后3 d于右顳枕區（手術區）頭皮下積液，經連續2次穿刺分別抽出15 mL淡咖啡色積液，術后3周時未再出現積液。

全部病例術后1周，三維CT顯示骨缺損區被組織工程骨充填，頭顱外形明顯改善。1例50歲女性患者，術后3個月CT顯示組織工程骨大部分被吸收（圖1）。其余患者術后3個月時，可見植入的細胞材料復合物形成高密度影，但較周圍正常顱骨密度稍低，組織工程骨和鄰近骨組織大部分融合，但部分連接區域有少量骨吸收現象，提示組織工程骨形成并基本修復骨缺損。術后6個月，CT顯示組織工程骨和鄰近骨融合，其中1例大面積顱骨缺損患兒修補中心區部分被吸收，周圍成活區呈高密度影，與正常骨融合良好（圖2）。

圖2 大面積顱骨缺損患兒修補中心區部分被吸收，周圍成活區與正常骨融合良好

3 討論

采用組織工程技術，以患者自體hBMSCs作為種子細胞，經體外大規模擴增后與部分脫鈣骨（pDBM）形成hBMSCs-pDBM復合物來修復大面積顱骨缺損，能夠避免目前顱骨缺損治療時自體骨來源不足、對自體骨供區的損傷等缺點，改變了“以創傷修復創傷”的傳統治療模式，為臨床顱骨缺損修復建立了新的治療模式。

組織工程技術通過從少量的骨髓組織中分離得到hBMSCs作為種子細胞，經體外誘導擴增達到一定細胞數量后，與支架材料復合，體外構建組織工程骨，來修復大面積顱骨缺損。其細胞能夠維持成骨細胞特有的生物學特性，同時避免了免疫排斥反應發生的可能。因此，新生的組織工程骨能與受區骨組織完全融合，修復的顱骨具有接近正常的大體外觀與組織學結構，并能維持正常的生理功能[6]。

支架材料是組織工程研究的重要因素。本研究中選用的支架為同種異體部分脫鈣骨。通過脫細胞、去蛋白、脫鈣等處理，使其抗原性大大降低；而保留了該支架材料特有的網狀結構和膠原成分。實驗表明，該材料有利于細胞黏附、分化和增殖，細胞材料相容性較好，植入體內后易被宿主骨細胞取代而降解，能滿足骨組織工程對基質材料的要求[8]。

對于小兒顱骨缺損，由于人工組織代用品無法隨患兒生長而生長，修復手術往往推遲到成人后進行，增加了發生顱腦再損傷、腦發育不良、癲癇等并發癥的風險。采用組織工程技術修復顱骨缺損畸形，新生的組織工程骨與自體骨融合，可隨患兒生長而生長，故修復手術可在小兒時期進行，避免了上述不足。

目前，采用組織工程骨修復顱骨缺損尚處于起步階段，我們在臨床實踐中也發現有許多問題亟待解決。首先，高齡患者由于hBMSCs成骨能力與增殖能力較弱，導致細胞材料復合物在體內降解吸收較快，與新生骨的成骨速度不匹配；其次，在大面積顱骨缺損患者的應用中發現，缺損中心區存在細胞材料復合物吸收現象，而周緣區域能形成良好的組織工程骨，這可能與周圍血運好、中心部分血供較差有關。

相信隨著組織工程骨研究的進一步深入，組織工程骨修復顱骨缺損將具有廣闊的臨床應用前景。

[1]柴崗,張艷,劉偉,等.人骨髓基質細胞在骨組織工程臨床應用中的探討[J].中國臨床康復,2002,6(22):3340-3341.

[2]柴崗,張艷,王敏,等.人骨髓基質細胞誘導成骨細胞和脫鈣骨粘附率的研究[J].實用美容整形外科雜志,2003,14(2):66-68.

[3]柴崗,張艷,劉偉,等.組織工程骨在顱頜面骨缺損臨床修復中的應用[J].中華醫學雜志,2003,83（19）:1676-1681.

[4]柳榮軍.修復顱骨缺損的材料選擇[J].人民軍醫,2005,48:111-112.

[5]候立軍,盧亦成,于明琨,等.顱骨重建對創傷性顱骨缺損患者神經功能的影響[J].中華創傷雜志,2004,20:772-773.

[6]劉廣鵬,舒朝鋒,尹爍,等.低溫保存對人骨髓基質干細胞在脫鈣骨上體外增殖與成骨能力的影響[J].中華創傷骨科雜志,2006, 8:933-937.

[7]曹誼林,周廣東,劉偉,等.組織工程與創傷醫學[J].中華創傷雜志, 2005,21(1):25-28.

[8]張艷,柴崗,麻蓀香,等.骨髓基質干細胞修復顱骨缺損的實驗研究[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4:189-191.

Clinical Application of Auto-hBMSCs Acting as Seeding Cell for Tissue Engineered Bone on the Cranial Defects

WANG Yougang1,LI Xinqing1,LI Chunhe1,WU Zhiyuan1,CUI Lei2,LIU Guangpeng2,LI Yulin2,SUN Jian2.
1 Changzhou Second Hospital Affiliated Nanjin Medical University,Changzhou 213000,China;2 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.Corresponding author:LI Xinqing,CUI Lei.

ObjectiveTo investigate the clinical effect of hBMSCs acting as seeding cell for tissue engineer bone on the cranial defects.MethodsFrom June 2006 to February 2007,four patients with traumatic cranial defect were treated by using auto-hBMSCs acting seeding cellfor tissue engineered bone.Autogenic hBMSCs were isolated,proliferated and induced in vitro,then combined with partially demineralized bone matrix.After co-cultured for 1 week,the cell/scaffold complexes were used for implantation.Gross observation and 3 dimensional CT were performed before and after 1 week and 3,6 months implantation.ResultsThree dimensional CT at 1 week post-implantation showed that the defect was filled with engineered bone,and the gross appearance of skull was obviously improved.After 3 and 6 months,new bone formed and fused with host bone,and the defects were repaired in 3 patients.There was no any osteogenesis in an old patient with large defect.ConclusionAutogenic hBMSCs acting as seeding cell for tissue engineered bone can repair cranial defect.

Human bone marrow stromal cells(hBMSCs);Tissue engineering;Cranial defects;Clinical application

R687.3+4

A

1673－0364（2009）03－0125－03

2009年3月30日；

2009年5月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.002

常州市衛生局重大科研課題（ZD200610）。

213000常州市南京醫科大學附屬常州第二人民醫院（王有剛，李新慶，李春和，吳智遠）；200235上海市上海組織工程研究與開發中心（崔磊，劉廣鵬，李宇琳，孫劍）。

李新慶，崔磊。