應用生物反應器構建組織工程化血管的實驗研究

許志成 張文杰 李宏 周廣東 崔磊 劉偉 曹誼林

應用生物反應器構建組織工程化血管的實驗研究

許志成 張文杰 李宏 周廣東 崔磊 劉偉 曹誼林

目的探討利用生物反應器體外構建具有完整結構的組織工程化血管的可行性。方法從6月齡畢格犬頸總動脈獲取平滑肌細胞，頸外靜脈獲取內皮細胞，經體外培養擴增。然后，先將平滑肌細胞接種于聚羥基乙酸（PGA）上，形成細胞—材料復合物，將該復合物置于生物反應器內培養。模擬成年哺乳動物循環系統的參數，予以動態力學刺激（搏動頻率：75次/分；擴張量＜5%）。8周后，在其上接種內皮細胞，對照組不接種內皮細胞，培養5 d后取材檢測。結果組織學染色顯示，平滑肌纖維成分排列較規則，有層次感，內皮細胞完整；對照組未見內皮細胞層結構。結論利用生物反應器可在體外構建具有完整結構的組織工程化血管。

組織工程生物反應器血管構建

尋求理想的血管移植物是臨床亟待解決的重大課題，組織工程學為這一難題的解決帶來了希望。血管是在持續的血流動力學刺激下形成并生長的特殊組織，而體外靜態環境下構建的血管組織結構欠佳，缺乏正常的生理功能[1-4]。我們的前期實驗證實，在血管構建過程中引入力學刺激因素是可行的[5]。應用能模擬體內血液循環、血管搏動的裝置—生物反應器，可以產生具有一定力學強度的組織工程化血管平滑肌層[6-7]。本實驗在此基礎上，應用生物反應器構建具有完整內皮層與平滑肌層的組織工程化血管。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物

畢格犬，6月齡，體重8～10 kg，雌雄不限，上海農學院提供。

1．1．2試劑

胎牛血清（美國Gibco公司），PBS溶液，一抗:鼠抗人α-SM actin（α-smooth muscle actin）（美國DAKO公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗體（美國DAKO公司），二抗：EnVisin+TM Peroxidase Mouse（美國DAKO公司），goat anti-mouse lgG-FITC（fluorescein isothiocyanate）（美國Santa Cruz公司）。

1．1．3血管生物反應器的構造

血管生物反應器包括反應槽、控制器、壓力傳感器、電磁閥、貯液罐及蠕動泵，經連接組裝后可置于培養箱內[8]，使用前予以環氧乙烷熏蒸消毒。

1.1 ．4實驗分組

分實驗組(n=5)與對照組(n=5)。實驗組在生物反應器動態槽內予以動態力學刺激培養，對照組培養在生物反應器靜態槽內。

1．2方法

1．2．1血管平滑肌細胞的分離、培養

無菌切取犬一側頸總動脈，將動脈中膜剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻鋪于培養皿，貼壁后加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養液培養，細胞生長達匯合后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代后繼續培養，取第2代細胞用于實驗。

1．2．2血管內皮細胞的分離、培養

無菌切取一段犬頸外靜脈,PBS沖洗靜脈管腔2～3遍，至沖洗液清亮后，向靜脈管腔內灌入0.1%的Ⅰ型膠原酶2 mL，37℃消化15～20 min，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，洗滌后計數，接種于直徑60 mm的培養皿，加入EGM-2培養液，置于37℃、5%C02培養箱內進行培養，次日換液，以后每2～3 d換液1次。

1．2．3形態學觀察

倒置相差顯微鏡觀察細胞生長、增殖、基質分泌情況和細胞形態變化。當細胞生長達融合時，PBS沖洗，2%戊二醛固定24 h，收集細胞，常規超薄切片，HITACHI-800型透射電鏡觀察細胞的超微結構。平滑肌細胞-PGA復合物體外培養4～5 d，留取標本，經2%戊二醛固定，常規超薄切片，PHILIPS XL30-ESEM型掃描電鏡觀察細胞與材料復合物生長情況。

1.2.4 細胞鑒定

進行免疫熒光染色，第2代平滑肌細胞爬片，檢測α-SM actin；第3代內皮細胞爬片，檢測Ⅷ因子，以確定細胞來源。

1.2.5 細胞與PGA復合及生物反應器內特定參數下的動態培養

收集第2代平滑肌細胞，總數為2×107個，離心，去上清液，加入100μl含10%FBS的DMEM培養液，制成細胞懸液均勻接種于3 cm×2 cm×1 mm的片狀未編織PGA上，置于37℃、5%C02培養箱內，4 h后加入含10%FBS的DMEM培養液，靜置于培養箱內繼續培養，每天更換培養液。1周后，將細胞材料復合物卷裹于無菌硅膠管外部。實驗組：將其接于動態槽內接口，予以動態力學刺激，參數設定為：搏動頻率75次/分，擴張量＜5%，壓力為0～0.02 MPa，流量為0～80 mL/min，流量控制電壓為0～5 V（壓力、流量和流量控制電壓在給定的范圍內由零開始，每日漸增）；對照組：將其置于生物反應器靜態槽內培養。兩組均4～5 d換一次液。8周后收集內皮細胞，制成含內皮細胞總數為5×106個的細胞懸液50μL，均勻接種于管腔內表面，EGM-2培養液繼續體外培養，5 d后取材檢測。

1.2.6 檢測

常規石蠟切片，HE染色顯示血管平滑肌纖維，免疫組織化學染色檢測血管α-SM actin與Ⅷ因子。

2 結果

2．1平滑肌細胞培養與鑒定

組織塊貼壁培養后第5～6天，鏡下可見細胞從組織塊周圍爬出，貼壁后伸展變為長梭形，4 d后達融合狀態[7]。透射電鏡觀察第二代平滑肌細胞漿，見有長條形電子密度集中的細胞器—密斑，是平滑肌細胞特征性超微結構。免疫熒光檢測可見細胞胞漿呈現FITC綠色熒光表達，為α-SM actin陽性，空白對照及陰性對照（軟骨細胞）為陰性。上述結果說明，體外培養的第2代平滑肌細胞能表達其特征性指標。

2．2內皮細胞培養與鑒定

原代內皮細胞在接種培養皿后，2 h內貼壁并伸展，呈集落樣生長（圖1a），2周可達融合。傳代后的細胞呈現典型的鵝卵石樣形態，7 d達融合狀態（圖1b）。為鑒定細胞來源，取第3代細胞進行透射電鏡觀察，可見內皮細胞漿內有多個散在的高電子密度的長桿狀W-P小體（圖1c），是內皮細胞特有的超微結構；第3代細胞免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下可見內皮細胞胞漿呈現FITC綠色熒光，為Ⅷ因子陽性（圖1d），空白對照及陰性對照（軟骨細胞）胞漿未呈現FITC綠色熒光表達，均為陰性。上述結果說明，體外培養的第3代內皮細胞能表達其特征性指標，可用于組織工程化血管構建。

2．3大體觀察

培養8周后，可見新生的組織工程化血管形成。兩組血管均色澤光亮，質地均勻，管腔圓潤，具有一定的彈性（圖2）。

2．4組織學觀察

2．4．1 HE染色

實驗組可見PGA纖維基本已降解，平滑肌纖維排列規則，有層次感，分布較均勻，內層細胞結構連續完整；對照組細胞壁結構與實驗組未見明顯差異，但管壁內側未見明顯連續而完整的細胞層結構。

2．4．2免疫組織化學染色

兩組血管的血管壁均呈現層狀棕黃色顆粒沉積，為α-SM actin陽性表達。實驗組血管壁內側有連續棕黃色顆粒沉積，為Ⅷ因子陽性表達；對照組血管壁內側未見明顯Ⅷ因子陽性表達。說明實驗組在管壁內側接種內皮細胞后可產生結構完整的組織工程化血管（圖3）。

圖1 內皮細胞形態學觀察

圖2 組織工程化血管大體觀察

圖3 實驗組與對照組8周時的組織學檢測（200×）

3 討論

本實驗室前期實驗結果顯示，在生物反應器內動態培養6～8周，可形成具有良好組織學結構與生物力學性能的組織工程化血管平滑肌層[6-7]。但是，血管內皮細胞是血管內膜的主要成分，為扁平鱗狀細胞，隨血流呈單層縱向排列，細胞長軸與血流方向平行。內皮細胞對維持血流的穩定，維護血管壁的完整，穩定物質交換平衡，參與凝血與抗凝血活動，分泌血管舒縮物質，攝取、轉換或滅活血循環與局部產生的活性物質，調節平滑肌細胞生長等方面都起了至關重要的作用。因此，血管內皮層的構建也是至關重要的。

本實驗結果顯示，在生物反應器內動態環境下培養的組織工程化血管平滑肌層在復合內皮細胞后產生的組織工程化血管，組織學結構層次清晰，平滑肌層排列規則整齊，內皮細胞層完整。說明適宜的力學刺激有利于血管組織形成及細胞適應性再塑，促進內皮細胞分泌各種血管活性因子，并可間接增加纖溶酶的活性，從而減少內皮細胞脫落。適宜的力學刺激可以促進平滑肌細胞生長、增殖與分化，促進細胞定向排布，增加膠原含量，從而增加平滑肌細胞收縮特性。

本實驗中的生物反應器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。對于血管承受的流體剪切應力，即流動的血液順血流方向作用于腔側血管內皮細胞單位面積上的力，尚無法模擬，而這種力的作用對形成完整而牢固的內皮細胞層，以達到穩定血流與抗血栓的作用是至關重要的。因此，進一步研究的重點之一，就是完善生物反應器的結構，使之能模擬流體剪切應力作用，以使其能完全模擬體內流體作用環境。

血管本身的生長發育是一個緩慢而復雜的過程，其生物力學性能也是隨著血管的不斷生長，在血流的不斷作用下而逐漸提高的。體外生物反應器的應用只是給予細胞—材料復合物以理想的啟動環境，使其在形成組織工程化血管的生長發育過程中更接近體內的環境。其實，構建組織工程化血管的最終目的還是要將其回植于體內，用于修復血管缺損，而體內的大環境才是血管生長成熟的最佳環境，體內真正的血流刺激才是最有效的作用因素。生物反應器內培養8周形成的血管組織已基本成熟，結構完整，并且具有一定的生物力學性能，下一步實驗中可將其回植體內，使其在血流的作用下，進一步生長發育，在適當的體內環境下達到完善和提高。

本實驗結果表明，在構建組織工程血管中，應力對血管平滑肌的生長增殖具有一定的促進作用，可以刺激平滑肌細胞生長、增殖與分化，促進細胞定向排布，增加膠原含量，從而增加平滑肌細胞收縮特性，有利于組織形成及細胞適應性再塑，也更有利于內皮細胞的復合。本實驗還證實，在生物反應器輔助下，體外可構建具有完整組織學結構的組織工程化血管，為下一步的體內回植實驗奠定了基礎。

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Experimental Study on Tissue Engineered Blood Vessel with Bioreactor

XU Zhicheng1,ZHANG Wenjie1,LI Hong2, ZHOU Guangdong1,CUI Lei2,LIU Wei1,CAO Yilin1.
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,The Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University Schoolof Medicine,Shanghai 200011,China.2 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center，Shanghai 200235,China.Corresponding author:CAO Yilin.

ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing tissue engineered blood vessels with bioreactor.MethodsCell-PGA(polyglycolic acid)complex was constructed by seeding smooth muscle cells(SMCs)isolated from canine carotid artery on PGA unwoven fibers.The cell-PGA complex was cultured in a bioreactor(pulse rate:75/min，radical distension＜5%).Eight weeks after culture in vitro,Endothelial cells(ECs)isolated from canine carotid vein were seeded on PGA and cultured for another 5 days.The control group was not seeded ECs.Tissue engineered blood vessels were harvested and examined.ResultsHistological staining revealed layered smooth muscle fibers and integral ECs in the tissue engineered blood vessel wall，which was further confirmed by immuno-histological staining.There were no obvious ECs were observed in the control group.ConclusionThe technology of bioreactor could be used to build tissue engineered blood vessel with mimic native blood vessel.

Tissue engineering;Bioreactor;Blood vessel;Reconstruction

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）03－0134－04

2009年2月13日；

2009年4月1日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.005

國家重點基礎研究發展規劃項目（2005CB522700）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整形外科（許志成，張文杰，周廣東，劉偉，曹誼林）；200235上海市上海組織工程研究與開發中心（李宏，崔磊）。

曹誼林。