巰基烷基化殼聚糖介導pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4真核雙表達質粒修復兔橈骨缺損的初步研究

邢艷莉 汪春蘭 趙宇 王幫河 白欣 李叔寶 盧迪

巰基烷基化殼聚糖介導pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4真核雙表達質粒修復兔橈骨缺損的初步研究

邢艷莉 汪春蘭 趙宇 王幫河 白欣 李叔寶 盧迪

目的研究以巰基烷基化殼聚糖（TACS）介導的雙核共表達質粒（pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4）修復骨缺損的作用。方法以新西蘭兔15只（30側）為實驗動物，制作橈骨中段15 mm長的骨缺損實驗模型，分實驗組（左側橈骨）和對照組（右側橈骨），實驗組植入明膠海綿+雙基因混懸液，對照組植入明膠海綿+等量生理鹽水，并于術后6周、8周、12周對骨缺損區進行大體觀察、X線觀察、X線阻射密度測定及組織形態學觀察，圖像分析骨小梁的生成數量。結果實驗組在12周內骨缺損完全修復，且同時期內新生骨的數量和質量顯著優于對照組；對照組骨缺損主要由纖維結締組織填充。結論TACS介導的pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4真核雙表達基因具有良好的促進骨缺損修復的能力。

骨缺損基因治療骨形態發生蛋白血管內皮細胞生長因子殼聚糖

骨缺損、骨不連是修復重建外科重要的研究方向，基因治療骨缺損是近年來研究的熱點。骨缺損的修復是多因素、多種生長因子共同作用的結果。目前單基因修復骨缺損的研究很多，而雙基因、多基因協同作用于骨缺損的研究尚不深入。骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）是具有誘導成骨活性的生長因子，血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是體內功能最強的血管生長因子，能促血管生成，并參與骨的再生與修復過程，在骨折愈合的不同階段幾乎都有表達。它在由BMP介導的成骨過程中非常重要，可與BMP通過聯合方式促進骨的再生[1-2]。本課題組通過前期研究，構建了pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4真核雙表達質粒[3-4]，現將本實驗室制備的巰基烷基化殼聚糖（Thiolated N-alkylated chitosan，TACS）[5]用于介導pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4雙核共表達質粒，并進行動物實驗，觀察其在骨缺損修復中的作用。

1 材料與方法

1.1 TACS為載體的真核雙表達質粒混懸液的制備

100μL TACS+1μL(pIRES-hVEGFl2lcDNA/ hBMP-4)+100μL Na2SO4（內含15μg/200μL的雙基因液），置55℃溫水溫浴15 min，再置于渦旋混合機渦旋混合30 s配成混懸液，置于4℃冰箱冷藏備用[6-8]。

1.2 動物模型的制備

取新西蘭成年兔15只（30側橈骨），雌雄不限，體重2.0～3.0 kg，分為實驗組（左前肢）和對照組（右前肢）。稱重后以3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉（1 mL/kg），雙前肢剃毛備皮。麻醉后，兔仰臥位，四肢固定于手術架上，以0.5%安多福常規消毒鋪無菌巾。于兔雙前肢前臂前內側縱行切開皮膚，鈍性分離皮下、肌肉組織，充分暴露橈骨中段，用骨刀骨鑿、咬骨鉗造成15 mm長的骨缺損，去除缺損處骨膜骨質。左側缺損處植入折疊好的可吸收明膠海綿（1cm×1cm×1cm）后以微量注射器注入雙基因混懸液（25μg/μL）為實驗組，右側以同法植入相同大小明膠海綿加等量生理鹽水為對照組。徹底止血后消毒，逐層縫合傷口。術后青霉素20萬單位肌注，連續3 d，相同條件分籠飼養。

1.3 骨缺損觀察指標

1．3．1大體觀察

術后觀察動物的飲食、活動及傷口情況，并于取材時進行橈骨缺損處的大體觀察。

1．3．2 X線檢查

分別于術后6周、8周、12周攝橈骨正側位X線片，投照條件統一為60 kV、100 mA、0.97 s、投照距離90 cm。阻射密度以同一照片骨缺損鄰近區域相同面積皮質骨密度為100，相同面積照片底色為0，測量骨缺損區阻射密度相對值，同一照片骨缺損區的平均阻射密度取所有可見阻射陰影密度的均值。

1．3．3組織學觀察

分別于術后6周、8周和12周時取材,對骨缺損中部組織以10%多聚甲醛固定，10%硝酸進行脫鈣后以石蠟包埋，進行連續的橫行及縱行切片（厚度5μm），HE染色，光鏡下觀察(每只動物取3張橫行間斷切片在100倍光鏡下觀察新骨形成情況，每張切片隨機取5個視野，利用Photoshop 6.0軟件分析新生骨小梁面積像素值，并計算其在視野總面積像素值的百分比。

1．3．4 BMP-4表達檢測

各組標本行BMP-4免疫組織化學染色，觀察其表達、分布情況；采用SP免疫組織化學法，一抗為兔抗人BMP-4單抗（進口分裝），DAB常規顯色。

1.4 數據處理

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行統計學處理。同一時間不同組標本骨缺損區的X線阻射密度、新生骨小梁面積占缺損區百分比等均采用方差分析。

2 結果

2.1 大體觀察

術后動物前肢不能負重，跛行，術后1周恢復正常活動。1只動物術后因傷口感染死亡。其余動物術后飲食正常，手術切口無紅腫及滲液，傷口Ⅰ期愈合，皮膚縫線自行脫落。術后6周取材，觀察實驗組骨缺損區有明顯骨痂生成，缺損部位為類骨樣組織充填，有一定強度；而對照組外周為纖維結締組織包裹。術后8周，實驗組新生骨組織的形成量明顯高于對照組。術后12周，實驗組骨缺損部位骨形成更加明顯，質地較硬，基本處于完全修復狀態；而對照組骨缺損處仍可見到骨缺損凹陷（圖1）。

2.2 X線觀察和X線阻射密度值測定

術后6周，實驗組橈骨缺損區可見明顯的骨生成影像，呈云霧狀，連續的小片狀骨痂分布在骨缺損區；而對照組僅在缺損兩端有少量的云霧狀骨痂生成，缺損區中央無骨生成影像。術后8周，實驗組缺損內有大量骨痂形成，連續性骨痂通過骨缺損；而對照組生成少量骨痂分布于缺損兩端，骨痂密度低于實驗組。術后12周，實驗組整個缺損區均可見到骨痂生成，髓腔再通，缺損完全修復；對照組僅在缺損兩端有骨痂生成，缺損區中央部分無明顯骨生成影像（圖2）。本實驗各組不同時段骨缺損修復的X線阻射密度值見表1。

2.3 組織學觀察（HE染色）和新骨成骨面積分析

實驗組：術后6周，在缺損區出現了大量的網狀骨小梁結構，其間血管豐富，可見到新生的類骨質形成，類骨質內增生活躍立方形的成骨細胞大量存在，有大量軟骨細胞，血管形成明顯。術后8周，缺損區骨小梁結構由新生編織骨替代，小梁骨減少，骨板排列無規律，形成致密板層骨，骨性骨痂大部分改建。術后12周，可見大量的編織骨樣組織，內含有大量的成骨細胞和骨凹陷，大量成熟板層骨橋，骨痂改建成熟，髓腔再通。

對照組：術后6周，缺損邊緣見纖維結締組織和炎性細胞浸潤，有少量成骨細胞、軟骨細胞，未形成明顯的骨小梁結構和骨樣基質。術后8周，缺損邊緣區有部分不規則骨小梁結構，缺損中央區為大量的纖維結締組織和少量骨質成分。術后12周，缺損區兩端可見有骨樣組織形成及骨小梁結構，缺損中央區為結締組織修復（圖3）。3組不同時相骨缺損區新生骨骨組織的圖像分析結果見表2。

2.4 免疫組化BMP-4表達檢測

免疫組織化學檢測顯示，術后6周實驗組深棕黃色顆粒狀物質為BMP-4，呈強陽性反應，分布于新生骨小梁及骨基質內，而對照組不規則骨小梁間隙內BMP-4表達微弱（圖4）。

圖1 實驗組（左橈骨）和對照組（右橈骨）術后6周、8周、12周時大體觀察（硝酸脫鈣1 d標本）

圖2 實驗組（左橈骨）和對照組（右橈骨）術后6周、8周、12周時X線表現

表1 X線分析骨缺損平均阻射密度

表2 新骨小梁占骨缺損區域面積百分比

圖3 實驗組（左橈骨）和對照組（右橈骨）術后6周、8周、12周時組織學觀察（HE染色，100×）

圖4 實驗組（左橈骨）和對照組（右橈骨）術后6周免疫組化BMP-4表達檢測（400×）

3 討論

骨缺損的修復是多因素、多種生長因子共同參與的結果，其中最重要的成骨因素是骨化和血管化的建立，在骨組織工程中聯合應用BMP和VEGF，可能會實現骨與血供的聯合重建。研究表明，VEGF和BMP的表達是個偶聯過程，兩者相互促進，起到級聯放大效應，能同時促進成骨和血管化，并且兩種基因具有協同作用。VEGF的產生與微環境中BMP的濃度呈正相關；VEGF也可以促進成骨細胞的分化，可以上調成骨細胞BMP的表達，加速骨組織的愈合，兩者在生物學功能上形成互補，進而加速骨誘導、骨形成過程，成骨效應優于單獨應用[6，9]。

殼聚糖（Chitosan，CS）屬陽離子多聚物，作為新型的非病毒基因載體，其改性后具有組織相容性好、轉染效率高、無毒、生物安全性好、來源廣泛、制備簡單等優點。CS帶有正電荷，易與DNA結合形成復合體，并使DNA具有抵抗核酸酶降解的能力。因此，本實驗采用了本課題組前期構建的巰基烷基化殼聚糖（TACS）為基因載體[5，10]。

基因治療分為體內和體外轉基因治療。體外轉基因治療需要收集培養靶細胞，費時且費用較高。體內轉基因治療是將基因附于載體直接導入活體內，操作簡便。有研究將BMP-4等基因的質粒以基因激活基質（膠原海綿）為承載體植入動物骨缺損部位，取得了滿意的成骨效果[11]；Li等[12]將包裹了BMP-2基因的腺病毒修復了兔橈骨缺損。因此，本實驗采用了體內基因轉移方法，利用與髓腔相通的骨缺損區局部的骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）為種子細胞結合含有TACS介導的pIRES-hVEGFl2l cDNA/hBMP-4共表達質粒混懸液的明膠海綿來修復兔橈骨缺損。明膠海綿具有多孔結構、良好的生物相容性和生物可降解性，提供了成骨傳導的基質，便于營養物質滲透及宿主間質細胞的趨化和聚集，加強了局部的成骨誘導效力。

本實驗對兔橈骨缺損模型修復過程進行了不同時間點的觀察。X線檢查示，實驗組在術后6周、8周缺損區骨痂形成的密度影較對照組明顯增高，12周時髓腔再通，缺損完全修復；組織形態學觀察顯示，同時期內實驗組新生骨的數量和質量顯著優于對照組，為成熟板層骨橋，骨痂改建成熟，髓腔再通；而對照組骨缺損中央區主要由纖維結締組織填充，缺損邊緣為間斷的骨小梁結構；免疫組化檢測的BMP-4在實驗組表達為強陽性，而對照組僅為弱陽性。我們認為，通過非細胞轉染而采用體內基因轉移方式應用到兔橈骨缺損中的TACS介導真核雙表達質粒（pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4）具有較好的促進骨缺損修復的能力，證實了BMP-4和VEGF121雙核共表達基因直接轉基因治療能夠加快骨缺損的修復，為臨床骨修復難題提供了新的解決途徑。但是，BMP-4和VEGF121最佳的給藥量和最適配比濃度問題，以及如何在動物實驗中鑒定巰基烷基化殼聚糖（TACS）的轉染效率等，仍需進一步研究。

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關于ISAPS

International Society of Aesthetic Plastic Surgery（ISAPS）是代表Board Certified整形外科醫生的最大的國際組織。40年前在美國紐約成立。目標是為其會員提供最新的醫學教育，向公眾和媒體傳播最新的及時訊息，促進世界范圍內安全的美容外科手術治療的發展。目前在世界上84個國家和地區中有1 600多位會員。

ISAPS可以自豪的追溯到25年前，當時1969年10月起草了第一個章程和規章。最后于1970年2月12日，在聯合國總部，正式完成了本組織的法案。在會員大會的有力支持下，ISAPS的創始成員和執委會成員領導協會戰勝了各種困難并抵御了各種誘惑。在創始會員的心目中，美容外科是整形外科的重要部分，ISAPS是IPRS（現在的IPRAS）的重要組成部分。ISAPS始終不渝地履行其重要的教育職責，這些包括客座教授參與的各種教學，技術出版物和聲像圖書館的建立。另一個重要的就是他的雜志：Aesthetic Plastic Surgery。

ISAPS高級研究班完全由ISAPS組織。ISAPS的教育委員會負責其內容和教員的選擇。ISAPS的第一任主席，Dr.John Lewis和他的執委會，在1972年里約熱內盧第一屆會議結束后，即刻決定，根據不同國家的不同美容外科發展水平，ISAPS應該在世界上組織周期性的不同層次的教育研究班。第一個教育研究班于1973年5月在意大利佛羅倫薩召開，獲得了空前的成功。隨后即在以色列開了第二次，政府官員和政要充分給予支持與合作。市長的歡迎詞中，特別強調在醫學領域中心理社會的重要性，將美容外科與文藝復興藝術比較。在短短的15年中，ISAPS共舉辦了42個研究班，大約有5 000名整形外科醫生參加。毫無疑問，這些研究班極大地推動了美容整形外科的發展。

A Preliminary Study of Thiolated N-alkylated Chitosan-mediated pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4 Eukaryotic Co-expression Plasmid to Repair RadialBone Defects in Rabbits

XING Yanli,WANG Chunlan,ZHAO Yu,WANG Banghe,BAI Xin,LI Shubao,LU Di.
Department of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230032, China.Corresponding author:WANG Chunlan,ZHAO Yu.

ObjectiveEvaluate the effect of Thiolated N-alkylated chitosan-mediated pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4 eukaryotic co-expression plasmid in repairing radial bone defects of rabbits.MethodsThirty radial bone defects(15 mm length)from 15 New Zealand rabbits were divided into 2 groups:the experimental group(left radial bone)and the control group(right radial bone).In the experimental group,defect was repaired by gelatin sponge+eukaryon co-expression plasmid and in the control group by gelatin sponge+Sodium Chloride.The osteogenesis in the bone defect was evaluated by radiograph and histology at 6,8,and 12 weeks after the surgery.The new bone formation was measured by radio-density quantification and image analysis.ResultsThe bone defect was completely repaired in the experimental group 12 weeks after the implantation.The results were better than the control groups.The bone defects in the control group was filled only with fibrous and connective tissues at 12 weeks after the surgery.ConclusionThiolated N-alkylated chitosan mediated pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP-4 eukaryotic co-expression plasmid can effectively repair radial bone defects.

Bone Defect;Gene Therapy;BMP;VEGF;Chitosan

Q782，R687.3+4

A

1673－0364（2009）03－0138－05

2009年4月8日；

2009年4月30日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.006

安徽省自然科學基金重點科研項目（070413090）。

230022安徽省合肥市安徽醫科大學第一附屬醫院整形外科。

汪春蘭，趙宇。