真核表達載體pIRES2EGFP-Cadherin-11的構建及其在BMSCs內的表達

柳大烈 王競鵬 林立新 王晉煌 陳兵 陳伯華

真核表達載體pIRES2EGFP-Cadherin-11的構建及其在BMSCs內的表達

柳大烈 王競鵬 林立新 王晉煌 陳兵 陳伯華

目的構建pIRES2EGFP-Cadherin-11真核表達載體，并檢測其在BMSCs中的表達情況。方法應用聚合酶鏈反應技術從人Cadherin-11 cDNA中擴增出Cadherin-11基因后，以內切酶Xho I和EcoR I進行雙酶切，將其插入用相同酶處理的載體pIRES2EGFP；將重組質粒轉染BMSCs，應用Western blot方法檢測其在細胞中的表達情況。結果酶切和測序結果表明，擴增的Cadherin-11基因序列正確，大小為2 390 bp；Western blot表明，Cadherin-11蛋白在BMSCs中正確表達，大小約88 kD。結論Cadherin-11蛋白能在BMSCs中高度表達，可望用于提高BMSCs與支架材料的粘附性。

骨髓間充質干細胞種子細胞組織工程細胞粘附構建

目前，骨缺損的治療多采用生物材料或非生物材料植入的方法進行修復，效果均不完美。組織工程技術的發展為骨缺損的修復提供了新的思路，而其核心是種子細胞和生物支架材料。理想的種子細胞應具有取材方便，增殖分化能力強的特點。目前，骨髓間充質干細胞（BMSCs）是構建組織工程骨最有應用前景的種子細胞之一，但其必須與材料發生適當的粘附，才能進行遷移、增殖和分化，所以黏附是種子細胞發揮功能的始動階段。當前，該領域的研究多集中于從材料的表面修飾、生化性質、空間構型等入手，甚少從種子細胞的基因修飾方面開展。盡管目前國內外有較多構建組織工程骨的報道，但種子細胞的成骨定向誘導分化及與支架材料復合過程中粘附性都有待加強，對提高種子細胞在修復過程中的“主導”作用尚沒有好的方法解決。因此對種子細胞進行基因修飾，可以解決構筑組織工程骨的關鍵步驟。基于以上考慮，本研究擬將鈣黏蛋白11（Cadherin-11）基因修飾種子細胞，使之具有良好黏附特性，并以生物可降解材料作為支架來構建組織工程骨。

1 材料和方法

1．1材料

質粒Cadherin-11 cDNA和pIRES2EGFP載體由日本神戶Riken分子生物中心Takeichi教授惠贈。大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。限制性內切酶、DNA連接酶、Taq酶購自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；DMEM培養基、Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；抗Cadherin-11蛋白抗體購自美國英杰生命技術公司。

1．2方法

1．2．1構建真核表達載體pIRES2EGFP-Cadherin-11

人Cadherin-11的PCR擴增：根據GenBank中報告的序列設計引物。上游引物為：5′-CCGCTCGAGATGAAG GAGAACTACT GTTTAC-3′；下游引物為：5′-CGGAATTCTTA AGAATCGTCATCAAAATGTCT-3′；上下游引物分別攜帶Xho I和EcoR I酶切位點。PCR引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。PCR模板為人的Cadherin-11 cDNA，PCR反應條件為：首先94℃變性1 min，然后以52℃復性1 min，72℃延伸5 min，進行25個循環。

1．2．2真核表達載體的酶切鑒定與測序

將純化后的上述PCR產物Cadherin-11經Xho I和EcoR I酶切后連接到經同樣酶切的pIRES2EGFP載體中，轉化大腸桿菌DH5α，提取轉化質粒。采用以上兩種內切酶進行酶切鑒定，得到目的基因大小片段的克隆判定為陽性克隆，然后進行測序。

1．2．3真核表達載體的蛋白表達鑒定

將測序正確的陽性克隆重新轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，去除內毒素后轉染BMSCs，用特異性抗Cadherin-11抗體檢測其表達蛋白大小。將BMSCs接種于6孔板內，待細胞融合達到90%時進行轉染，將2孔細胞分別轉染空載體和重組質粒pIRES2EGFP-Cadherin-11各0.5μg。轉染前2 h換上0.5 mL新鮮培養基，同時準備轉染混合液。轉染后4 h更換培養基，更換后培養基體積為4 mL。

1．2．4細胞培養

利用密度梯度離心法分離培養B MSCs，用含10%胎牛血清的DMEM培養基于培養箱（37°C，5% CO2）中培養。轉染前24 h將細胞接種于24孔板，細胞密度大約為90%。

2 結果

2.1 Cadherin-11片段的擴增和重組質粒的鑒定

將從質粒Cadherin-11 cDNA進行PCR擴增得到的PCR產物用1%瓊脂糖電泳，可見在2 390 bp附近有一條帶，與預計的目的片段大小位置相符（圖1A）。pIRES2EGFP-Cadherin-11重組質粒分別經Xho I和EcoR I雙酶切后產生約2 390 bp大小的目的片段（圖1B）。

圖1 Cadherin-11片段的PCR擴增和重組質粒的鑒定

2．2重組質粒pIRES2EGFP-Cadherin-11的真核表達鑒定

將重組質粒pIRES2EGFP-Cadherin-11轉染B MSCs細胞后進行Western blot檢測，在88 kD附近見到條帶，與預計蛋白大小相同。

3 討論

Cadherin-11是促進黏附的重要分子之一。Cadherin-11屬鈣黏附蛋白家族，是一種鈣離子依賴性介導細胞間黏附的單鏈跨膜糖蛋白，主要通過其胞外結構域發揮黏附作用，激活PKC等信號通路，與連環蛋白相連，引起細胞骨架蛋白構象改變，最終發揮其生物活性[1]。另外，它與胚胎肢節形成、骨組織和神經元等的形成、腫瘤浸潤轉移等關系密切[2－3]。Cheng等[4]認為BMP-2的促成骨效應即借助于Cadherin-11的功能。鈣黏附蛋白介導的細胞-細胞黏附通過增強細胞成熟信號，激活堿性磷酸酶、骨鈣素（OCN）等成骨細胞相關基因的表達，在成骨細胞分化的過程中發揮著重要作用。基因敲除實驗證實，胚胎發育中Cadherin-11影響著成骨細胞分化過程中的細胞排列、聚集及分離。Bourne等[5]用Cadherin-11抗體對胚胎干細胞進行磁珠分選，發現獲得的細胞利于細胞的成骨分化并激活細胞的重排。這些證據表明，利用Cadherin-11基因對BMSCs進行基因修飾，可望促進細胞的黏附性能。

盡管Cadherin-11可以提高黏附特性，但僅是啟動了細胞發揮細胞生物功能的第一步，是否能向特定細胞表型（成骨細胞方向）分化尚不確定。目前已有報道利用BMPs、TGF-β、IL-6、LMP-1等可促進成骨分化，然而這些方法誘導細胞分化特異性差，需要劑量大，費用高，最為重要的是不能在種植局部提供持續的骨誘導信號[6-7]。為適應構建組織工程骨的要求，有必要尋求一種能高效、特異定向分化的方法。因此，有學者在支架材料表面加附各種細胞粘附因子：如膠原、纖黏蛋白（FN）、層黏連蛋白及RGD短肽等。Chuang等[8]證實生物材料用同種細胞外基質包埋后，其吸附細胞的數量增加了48%，提示ECM中的這類成分能增加細胞的黏附力。亦有學者對材料表面理化性質進行改造（如等離子處理、機械牽張等），以提高細胞的黏附和伸展[9-10]。然而這些方案更多地是從材料的生物相容性考慮，沒有從細胞這一內因著手，故而對提高細胞黏附的能力有限。我們在利用成骨樣細胞與膠原包埋的PGA復合構建組織工程骨時發現，種子細胞與支架材料黏附存在不確定性。Cutlera等[11]利用種子細胞表達Fn增強與整合素結合，從而促進細胞與材料的黏附。因此，我們嘗試利用成骨特異性鈣黏蛋白（Cadherin-11）對種子細胞進行基因修飾。首先應用基因克隆技術將Cadherin-11基因成功插入真核表達載體pIRES2EGFP中，PCR結果顯示獲得了大小正確的Cadherin-11基因片段，酶切和測序結果表明，pIRES2EGFP-Cadherin-11重組質粒構建成功。為了進一步驗證該重組質粒在BMSCs中是否表達Cadherin-11蛋白，我們利用轉染和免疫印跡的方法進行檢測，結果表明，在BMSCs細胞中能夠檢測到Cadherin-11蛋白，大小正確，說明構建的重組質粒具有表達能力，為下一步的實驗奠定了基礎。

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本刊協辦單位名錄

上海威寧整形制品公司 四川西蟬整形美容醫院

上海迪加科技有限公司 中山市冠鷹醫療器械制造有限公司

上海索康醫用材料有限公司 奇致激光技術（中國）有限公司

蔡司光學儀器（上海）國際貿易有限公司 上海康寧硅膠制品有限公司

北京科儀真燕山醫療技術有限公司 蘭州生物技術開發有限公司

Experimental Study on the Construction of pIRES2EGFP-Cadherin-11 Eukaryotic Vector and the Expression of BMSCs

LIU Dalie1,WANG Jingpeng1,LIN Lixin2,WANG Jinhuang1,CHEN Bin1,CHEN Bohua1.
1 Department of Plastic Surgery,Zhujiang Hospital,The South Medical University,Guangzhou 510282,China;2 Department of Plastic and Aesthetic Surgery,Yuhuangding Hospital,Yantai 264000,China.

ObjectiveTo construct pIRES2EGFP-Cadherin-11 eukaryotic vector and detect its expression in BMSCs cells.MethodsCadherin-11 genes were amplified from human cadherin-11(CDH11)cDNA by polymerase chain reaction (PCR)and cloned into pIRES2EGFP.After the recombinant plasmid was transferred into BMSCs,protein expression of the plasmid was examined by Western blot.ResultsDNA sequencing and enzyme digestion showed that the cloned cadherin-11 gene was correct.It was about 2 390 bp.The expression of cadherin-11 protein in BMSCs were 88 kD.ConclusionCadherin-11 is a Ca2+-dependent homophilic cell adhesion molecule that is expressed mainly in osteoblasts.The data suggested that cadherin-11 protein can express in BMSCs and improve the adhesion between BMSCs and scaffolds.

Bone mesenchymal stem cells;Seeding-cells;Tissue engineering;Cell adhesion;Construction

Q781

A

1673－0364（2009）03－0131－03

2009年4月3日；

2009年5月7日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.004

國家自然科學基金（30570517）。

510282廣東省廣州市南方醫科大學附屬珠江醫院整形美容科（柳大烈，王競鵬，王晉煌，陳兵，陳伯華）；264000山東省煙臺市煙臺市毓璜頂醫院整形美容科（林立新）。