高滲鹽水聯合丹參預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用研究

竇俊峰　王家祥

（1.鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052；2.河南省衛生學校附屬醫院，河南 安陽 455000）お

摘 要：目的：研究高滲鹽水聯合丹參預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及作用機制。方法：將75只健康雄性SD大鼠（體重230g左右），隨機分為5組，每組15只：假手術組（Ⅰ組）、缺血再灌注組（Ⅱ組）、高滲鹽水預處理組（Ⅲ組）、丹參預處理組（Ⅳ組）和高滲鹽水聯合丹參預處理組（Ⅴ組）。分別建立大鼠肝臟缺血再灌注模型，觀察肝臟缺血30min再灌注6h后血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）和腫瘤壞死因子-α （TNF-α）水平并觀察肝組織病理學改變。 結果：Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清中ALT、AST、LDH和TNF-α含量明顯高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組明顯低于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組明顯高于Ⅴ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組之間差別無統計學意義（P>0.05）。肝組織病理學損害：Ⅰ組最輕，Ⅱ組最重，Ⅲ、Ⅳ組次之，Ⅴ組輕于Ⅲ、Ⅳ組。 結論： 高滲鹽水、丹參預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷均具有保護作用，2種藥聯合應用效果更好。

關鍵詞：大鼠；肝臟；缺血再灌注損傷；高滲鹽水；丹參；藥物預處理

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0013-02

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科疾病中常見的病理過程，它可使肝代謝解毒能力降低、微循環阻力升高，嚴重者可導致肝功能衰竭，直接影響到疾病的預后、手術成功率和病人存活率。因此，對肝臟缺血再灌注損傷作用機制及防治的研究，具有很重要的臨床意義。最近研究表明高滲鹽水和丹參對大鼠肝臟缺血再灌注損傷有一定的保護作用^[1-3]；但是兩藥聯合應用是否具有更好的效果尚無定論。本實驗研究觀察了兩藥聯合應用對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，并初步探討了其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠75只，體重230g左右，河南省實驗動物中心提供。

1.2 實驗用藥品及試劑

血清TNF-α試劑盒購于中國人民解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。

1.3 實驗分組

健康雄性SD大鼠75只隨機分為5組，每組15只：假手術組（Ⅰ組）、缺血再灌注組（Ⅱ組）、高滲鹽水預處理組（Ⅲ組）、丹參預處理組（Ⅳ組）和高滲鹽水聯合丹參預處理組（Ⅴ組）。術前禁食12h，自由飲水。

1.4 實驗方法

麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg體重）。Ⅰ組：單純麻醉和開腹，分離出肝十二指腸韌帶，不阻斷肝門；Ⅱ組：麻醉后開腹，開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射生理鹽水（10mL/kg體重）。用無損傷動脈夾夾閉肝蒂，30 min后移走動脈夾恢復灌流，松開無損傷動脈夾恢復血流開始再灌注計時，關腹。再灌注6h后開腹，自腹主動脈取血4mL、2mL送本院生化檢驗中心檢測ALT、AST和LDH，其余血室溫靜置30min后，3000r/min離心30min，提取血清標本-20℃保存待測TNF-α。取1.0cm×1.0cm×0.5cm大小左肝組織，置于10％ 中性甲醛溶液中，備做光鏡檢查。Ⅲ組：開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射高滲鹽水（濃度7.5%，10mL/kg體重），其余步驟同Ⅱ組。Ⅳ組：開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射丹參注射液（10mL／kg體重），其余步驟同Ⅱ組。Ⅴ組：開腹前10min自陰莖背靜脈緩慢注射丹參注射液5mL／kg體重和高滲鹽水（濃度7.5%，5mL/kg體重），其余步驟同Ⅱ組。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 血清生化酶檢測

全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）。1.5.2 血清TNF-α檢測

按照試劑盒說明書檢測血清TNF-α。

1.5.3 肝組織病理學檢查

10％中性甲醛溶液固定的肝組織塊石蠟包埋后，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織學變化。

1.6 統計學分析

采用SPSS11.5統計軟件進行統計分析，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析（F檢驗），組間比較用q檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清生化酶的改變

肝臟缺血30min再灌注6h后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清ALT、AST、LDH水平明顯高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組明顯低于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組明顯高于Ⅴ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組之間差別無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 血清腫瘤壞死因子-α

肝臟缺血30min再灌注6h后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清腫瘤壞死因子-α水平明顯高于Ⅰ組（P<0.05）；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組明顯低于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組明顯高于Ⅴ組（P<0.05）；Ⅲ組和Ⅳ組之間差別無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 病理組織學觀察

光鏡下觀察，Ⅰ組肝小葉結構及肝竇內皮細胞均正常，肝竇暢通；Ⅱ組肝小葉結構紊亂，肝竇嚴重狹窄，肝細胞水腫變性，可見部分肝細胞壞死；Ⅲ組可見部分肝細胞變性，肝血竇內輕度瘀血，未觀察到明顯的壞死細胞；Ⅳ組肝小葉結構尚可，可見部分肝細胞變性，肝竇仍然保持暢通，未觀察到明顯的壞死細胞；Ⅴ組肝小葉結構基本正常，肝竇暢通，無明顯的肝細胞壞死。

3 討論

在復雜肝切除術和肝移植等手術時肝臟缺血再灌注損傷常常難以避免，減輕肝臟缺血再灌注損傷，可從多方面、多角度著手，目前預防肝臟缺血再灌注損傷的措施有藥物預處理、缺血預處理、熱休克預處理、臭氧氧化預處理、缺氧預處理、局部熱應激預處理、缺血后處理等。在眾多的處理措施中又以藥物預處理的應用前景最為廣闊。

藥物預處理是指利用某些活性物質直接或間接的藥理作用來達到增強組織或細胞對缺血再灌注損傷的耐受性作用，從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。

高滲鹽水用于治療肝臟缺血再灌注損傷的實驗研究報道不是很多，結果顯示在治療肝臟缺血再灌注損傷的治療中，高滲鹽水有其特有的作用機制，它能提高機體血容量，改善微循環^[4]，增加心臟功能，改善血液動力學，并能減輕血管內皮細胞腫脹及肺泡內皮細胞腫脹，減少組織器官淤血和水腫，從而減輕全身性炎癥反應。FAHMEN等^[5]研究也表明高滲鹽水能減少中性粒細胞介導的炎性反應所致的組織損傷。最近有學者研究發現，高滲鹽水預處理明顯增強缺血再灌注后肝臟血紅素加氧酶-1（HO-1）mRNA及蛋白表達，明顯改善肝臟微循環，對肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用。但是高滲鹽水的作用機理目前還不十分清楚，尚需進一步研究。

丹參是近年來引起人們重視的一種傳統中藥，國內在丹參對動物肝臟缺血再灌注損傷的研究上已經取得一定成果，證明其在酶學指標和組織切片上都有一定的效果。丹參注射液是丹參中提取的混合液，主要成分為丹參素、丹參酮、隱丹參酮和原兒茶醛等，臨床上可輔助治療多種病因引起的肝臟損傷^[6]。丹參對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，其作用機制與抗氧自由基、抑制細胞凋亡及改善低溫保存肝臟的能量代謝作用有關^[7]。同時丹參還能保護缺血或殘肝細胞以促進肝細胞再生，并可在低溫情況下提高組織中ATP含量和Na+-K+-ATP酶活性繼而減輕器官在低溫下的損傷^[8]。本實驗通過聯合應用高滲鹽水和丹參探討它們對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，結果顯示單獨應用高滲鹽水或丹參均能明顯降低血清中AST、ALT、LDH及TNF-α的水平，聯合應用效果更好，已經過病理觀察證實。

綜上所述，我們認為高滲鹽水和丹參可以降低肝臟缺血再灌注時TNF-α的水平，減輕TNF-α介導的一系列肝臟損傷，從而對肝臟缺血再灌注損傷起保護作用，兩藥聯合應用具有協同作用。

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（責任編輯：陳涌濤）