時間分辨熒光免疫分析法測定甲胎蛋白的臨床評價

霍繼煒

（撫順市中心醫(yī)院，遼寧 撫順 113006）お

摘 要：目的：評價時間分辨熒光免疫分析法測定甲胎蛋白的臨床應(yīng)用價值。方法：分別用時間分辨熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行AFP測定，進(jìn)行相關(guān)性分析、精密度試驗和線性分析。結(jié)果：兩法呈正相關(guān)，都有較好的重復(fù)性，但時間分辨熒光免疫分析法的CV值明顯小于酶聯(lián)免疫吸附法，時間分辨熒光免疫分析法比酶聯(lián)免疫吸附法具有更寬的檢測范圍。結(jié)論：應(yīng)用時間分辨熒光免疫分析法檢測AFP，具有靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點，有著良好的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：甲胎蛋白；時間分辨熒光免疫分析；酶聯(lián)免疫吸附

中圖分類號：R446.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0104-02

甲胎蛋白（AFP）是胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白，分子量約68000，由96％蛋白質(zhì)和4％的碳水化合物組成，成人由肝細(xì)胞產(chǎn)生，血清中含量極微。AFP是診斷肝癌最特異的標(biāo)志物^[1]，其靈敏度和特異性已經(jīng)達(dá)到甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過CT、MRT、同位素掃描、超聲波檢查和血清酶學(xué)檢查，同時檢測孕婦血清中的AFP含量可用于神經(jīng)管缺損畸胎的篩查。這些領(lǐng)域均須對AFP進(jìn)行定量測定，臨床上檢測AFP的方法有很多，本文采用時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對65份血清進(jìn)行AFP測定，報告如下。

1 材料與方法

1.1 病人與標(biāo)本

本院2007年8月-12月收治的65例肝癌患者，血清學(xué)AFP檢測陽性，經(jīng)影像學(xué)、組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肝癌，抽取肝癌住院患者晨血5mL，EDTA抗凝。將其中15份血清混合后分裝（用于精密度試驗），置于-20℃冰箱中保存，集中測試。

1.2 儀器與試劑

TRFIA采用WALLAC公司生產(chǎn)的AutoDELFIA1235型全自動時間分辨熒光分析儀，測定試劑盒為蘇州新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，自帶標(biāo)準(zhǔn)物，檢測過程均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，ELISA采用美國Bioeheek公司產(chǎn)品，定量試劑盒為鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

（1）TRFIA。AFP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品25μL／孔→分析緩沖液200μL→室溫慢速振動60min→洗板2次→已稀釋（1∶50）的Eu3+標(biāo)記溶液200μL→室溫慢速振動60min→洗板6次→增強(qiáng)液200μL→室溫慢速振動孵育5min→測定熒光值，自動計算AFP值。

（2）ELISA。稀釋液100μL/孔→血清樣本20μL→37℃孵育30min→洗板4次→酶標(biāo)抗體150μL/孔→37℃孵育30min→洗板→顯色→酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)測定，自動擬合曲線并計算AFP含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)性分析

用上述兩種方法對50份受檢血清進(jìn)行AFP定量分析，測定結(jié)果作相關(guān)性分析，結(jié)果表明，兩種方法差異無顯著性（P>0．05），直線回歸方程為：Y（TRFIA）=0.938X（ELISA）+0.988，r=0.94，兩法呈正相關(guān)。

2.2 精密度試驗

參照NCCLS的精密度評價方案^[2]，用時間分辨熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法分別對高、中、低3個濃度（參考值分別為800μg／L，170μg／L，5μg／L）的AFP質(zhì)控血清進(jìn)行重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，兩種方法都有較好的重復(fù)性，但時間分辨熒光免疫分析法的CV值明顯小于酶聯(lián)免疫吸附法，見表1。

2.3 線性分析

取高值混合血清作6點倍比稀釋，各復(fù)測3次，以原倍血清測定值為標(biāo)準(zhǔn)按稀釋倍數(shù)算得其理論值，與兩種方法實際測定值比較進(jìn)行線性分析，TRFIA回歸方程為：Y=1.04X+7.26，r=0.96；ELISA回歸方程為：Y=0.63X+45.31，r=0.91。TRFIA在0.72～1078ng／L范圍內(nèi)線性良好；ELISA在4.21～535ng／L范圍內(nèi)線性良好。時間分辨熒光免疫分析法比酶聯(lián)免疫吸附法具有更寬的檢測范圍。

3 討論

時間分辨熒光免疫測定的基本原理是以鑭系元素銪（Eu）螯合物作為熒光標(biāo)記物，利用這類熒光物質(zhì)壽命長的特點，延長熒光測量時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測定，所得信號完全為長壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效排除非特異性本底熒光的干擾而提高靈敏度。TRFIA法的固相技術(shù)，也是保持其靈敏度的一個重要因素，同時增強(qiáng)液在TRFIA中的作用特別重要，優(yōu)質(zhì)的增強(qiáng)液是提高檢測靈敏度的另一個關(guān)鍵因素，加入增強(qiáng)液后，可以使Eu3+從反應(yīng)復(fù)合物中解離下來，游離的Eu3+同增強(qiáng)液中的另一種螯合劑形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在激發(fā)光的激發(fā)下能夠發(fā)出強(qiáng)烈熒光，信號可以增強(qiáng)100萬倍^[3]。TRFIA法的批內(nèi)、批間精密度均比ELISA法好，這可能是由于TRFIA法利用了具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，幾乎完全消除了背景熒光的干擾，且試劑穩(wěn)定性好，因而檢測重現(xiàn)性好；ELISA法檢測影響因素較多，另外，ELISA法定量AFP試劑盒的線性及標(biāo)準(zhǔn)問題是測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，ELISA法的“鉤狀效應(yīng)”，即測定顯色隨著待測標(biāo)本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度隨抗原濃度的增加而開始下降至不顯色，容易造成假陰性結(jié)果。另外，TRFIA的線性范圍更寬，也是因為TRFIA采用Eu3+作標(biāo)記物，由于Eu3+發(fā)光信號具有寬線性，同時采用獨(dú)特的熒光解離增強(qiáng)技術(shù)，即通過加入增強(qiáng)液，標(biāo)記物Eu3+在DELFIA體系中有非常優(yōu)良的可檢測性，大大提高了TRFIA的檢測線性。總之，應(yīng)用時間分辨熒光免疫分析法檢測AFP，具有靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，有著良好的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 劉寶善.消化器官腫瘤學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：475．

［2］ 楊昌國，許葉，張抗．精密度評價和方法比較中NCCLS評價方案的應(yīng)用［J］．臨床檢驗雜志，1999，17（1）：47-49．

［3］ 杭建峰，吳英松，李明．時間分辨熒光免疫分析的研究進(jìn)展及應(yīng)用［J］．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2004，4（3）：340-342．

（責(zé)任編輯：姜付平）