動物細胞無血清培養基的優勢、特點與實驗研究

王曉南　王麗環　高　鵬

摘 要：動物細胞無血清培養基相比天然培養基、合成培養基等傳統培養基有無可比擬的優勢，其組成成分相對清楚，制備過程簡單，日益得到生物技術界的重視。運用統計學實驗方法，可科學有效地考察細胞培養基中多因素、多水平間的交互作用。應用新型蛋白質組分分析技術及生物芯片技術定位胞漿信號通路相關蛋白、膜表面的生長因子受體、激素受體、細胞因子受體、粘附分子等，用以確定細胞培養基中調控分子的添加組合。對無血清培養基的優勢特點及常用的實驗研究進行概述。以期為動物細胞無血清培養基的研究與研制提供參考。

關鍵詞：動物細胞；無血清培養基；實驗設計

中圖分類號：R-332文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）02-0021-03

動物細胞培養技術是當今生物工程領域中的前沿研究課題之一，無論是在基礎研究還是生產實踐方面都得到生物技術界的重視。隨著哺乳動物細胞培養規模的擴大和生物藥物需求的增長，基于細胞及產品特性的無血清培養基的研制已成為細胞工程領域的重要課題。無血清細胞培養技術的研究日益得到人們的重視。近年來，有關無血清培養基的研制和開發得到了迅速發展，推動了基因工程產品及產業的發展。

1 無血清培養基的優勢特點及分類

細胞培養基是細胞體外培養的最重要因素。無血清培養基是繼天然培養基、合成培養基之后的第三類培養基。與傳統的培養基相比，無血清培養基是一種不含有動物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養基。無血清培養基由于其組成成分相對清楚，制備過程簡單，在現代生物技術學領域得到廣泛應用。無血清培養技術也是闡明細胞生長、增殖、分化及基因表達調控的基礎研究問題的有力工具。

常規細胞培養基的制備方法是在基礎培養基中添加相應量的血清或組織提取物，其中最常用于培養基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規血清細胞培養基存在以下缺點：

（1）血清來自于動物體，其對細胞在體外培養時的主要作用是提供生長因子、激素、結合蛋白，并提供保護作用，但同時也有細胞生長抑制因子和毒性因子，所以存在潛在毒性。

（2）由于動物血清提取的局限，使其應用于培養基的價格格外昂貴。

（3）動物血清提取的局限，也給細胞培養的標準化帶來困難，同時也存在細胞培養表達產品分離純化難的問題，具有潛在的細胞毒性作用，給規?；囵B細胞增加了難度［1］。

由于上述常規血清細胞培養基存在的諸多問題，促使我們改進培養方法，用無血清細胞培養基來替代。細胞工程中無血清培養技術的應用，在很大程度上可以避免含血清培養所帶來的不利。無血清培養基具有以下明顯的優缺點：

無血清培養基的優點:

（1）可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養和實驗結果的重復性。

（2）避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

（3）避免血清組分對實驗研究的影響。

（4）有利于體外培養細胞的分化。

（5）可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。

缺點：

（1）細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便。

（2）成本較高。

（3）針對性很強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。

發展無血清培養基，除了開發化學合成培養基外，也可以尋找適當的具有類似于血清功能的生物分子來替代血清。目前，無血清培養基的研究有兩個方向：一是培養基中不含有任何動物來源的添加組分；二是培養基中不含有不明確的添加組分。依次可以將當前應用較多的無血清培養基歸納為以下4種：

（1）無血清培養基。此為一般意義上的無血清培養基，是由各類可替代血清功能的生物材料配制成的細胞培養基，如牛血清白蛋白（BSA）、轉鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質，以及從血清中提取的去除蛋白質的混合脂類以及水解蛋白等。其特點是培養基中的蛋白含量較高，添加物質的化學成分不明確，其中含有大量的動物來源蛋白［2］。

（2）無動物來源培養基。許多商業公司開發的無動物來源培養基是基于生產重組藥物的安全考慮，培養基中的添加組分無動物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細胞生長及增殖的需要。

（3）無動物蛋白培養基。培養基完全不用動物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養基組分相對穩定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對培養的細胞是高度特異性的［3］。

（4）化學組分限定培養基［4，5］。此類培養基是目前最安全、最為理想的培養基，首先可以保證培養基批次間的一致性，其中所添加的少量動物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點是培養基的性質明確，有利于進行細胞培養的代謝研究，同時分離純化也比較方便。

2 無血清培養基的實驗研究

無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用，而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力；或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產物。

2.1 無血清培養基的基本配方

基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。

2.2 添加組分

2.2.1 促貼壁物質

許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2.2.2 促生長因子及激素

針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

2.2.3 酶抑制劑

培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中酶抑制劑必不可少，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。

2.2.4 結合蛋白和轉運蛋白

常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。

2.2.5 微量元素

硒是最常見的微量元素。

2.3 使用方法

目前，血清仍是動物細胞培養中最基本的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%、1%，直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發生變化。

為了使細胞適應無血清培養，關鍵是使所培養細胞處于如下狀況：

（1）處于對數生長中期；

（2）>90%活細胞率；

（3）適應時以較高的起始細胞接種。

細胞適應無血清培養基的方法：

直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中。

一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×10⁵-3.5×10⁵細胞/mL。當細胞密度達到1×10⁶-3×10⁶細胞/mL時，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4~7天后達到2×10⁶~4×10⁶細胞/mL時，細胞完全適應了無血清培養基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×10⁶~3×10⁶細胞/mL，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。

(1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基-25％SFM混合培養基中，傳代培養。

（2）當細胞密度>5×10⁵細胞/mL時，以2×10⁵~3×10⁵細胞/mL細胞密度，在有血清培養基：SFM為50∶50的混合培養基中傳代培養。

（3）以2×10⁶~3×10⁶細胞/ml細胞密度，25％有血清培養基和75%SFM中傳代培養。

（4）當細胞密度達到1×10⁶~3×10⁶細胞/mL（接種后4~6天），在100％SFM培養基中傳代培養。

（5）每隔3~5天，當細胞密度達到1×10⁶~3×10⁶細胞/mL，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

建議備份前一次混合培養的培養物，直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。

在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養適應替代血清：許多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的培養基和包含有替代血清的培養基1∶1（v∶v）的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式，連續幾代減少當前培養基的量：從1∶2到1∶4再到1∶16直至100％替代培養基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2~3次。

培養直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發生，允許進行2~3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是：配制無血清培養液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經3次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏血清中天然成分未中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

3 結語

動物細胞無血清培養基的研究方法運用了基因組技術、蛋白質組技術、代謝工程技術、計量分析方法等。另外，有關無血清培養基在線數據庫的建立也方便了相關信息的檢索與分析［6］，為無血清培養基的設計提供了更多的信息。

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大，將會有更多的科學方法運用到細胞培養基的設計與研究中［7］。新一代動物細胞無血清培養基將具有“無血清、無蛋白、無動物來源、成分確定”的特性，同時在功能上屬于安全、通用的高效培養基，這種細胞無血清培養基在細胞工程領域中將會得到廣泛應用。

參考文獻：

［1］ Even M S，Sandusky C B，Barnard N D. Serum-free hydridoma culture:ethical，scientific and safety considerations［J］. Trends in Biotechnology，2006，24(3):105-108.

［2］ Keen M J，Rapson N T. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line［J］. Cytotechnology，1995，17 (3) :153-163.

［3］ Schroder M， Matischak K， Friedl P. Serum-and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11［J］. Journal of Biotechnology，2004， 108 (3): 179-292.

［4］ Hesse F， Wanger R. Developments and improvements in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures［J］. Trends Biotechnology，2000， 18 (4): 173-180.

［5］ Chen Z L， Iding K， Lutkemeyer D， et al. A low-cost chemically defined protein free medium for a recombinant CHO cell line producing prothrombin［J］. Biotechnology Letters，2000， 22 (10): 837-841.

［6］ Falkner E， Appl H， Eder C， et al. Serum free cell culture: The free access online database［J］. Toxicology in Vitro， 2006， 20 (3): 395-400.

［7］ Wurm F M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells［J］. Nature Biotechnology， 2004， 22 (11): 1393-1398.

（責任編輯：陳涌濤）