慢病毒載體的構建及其在基因治療方面的應用

湯海濤　安春麗

摘 要：慢病毒屬于逆轉錄病毒科，為RNA病毒。經改造的慢病毒作為外源基因載體，具有其獨特的特點和優勢。基因治療成功的關鍵是選擇合適的載體系統，慢病毒載體作為一種特殊的逆轉錄病毒載體，具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點，已成為當前基因治療載體研究的熱點。近年來對其基礎生物學特性、載體改造及其應用等研究均取得了較大進展，筆者對慢病毒載體的構建以及其在人類疾病基因治療方面的應用做簡單的介紹。

關鍵詞：慢病毒載體；載體構建；基因治療

中圖分類號：R373文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）02-0142-03

基因治療是向靶細胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補償基因的缺陷，關閉或抑制異常表達的基因，從而達到治療的目的。其關鍵問題之一是如何將目的基因導入靶細胞，得到穩定、高效表達。理想的基因載體應具備：靶向特異性；高度穩定、易制備、可濃縮和純化；無毒性；有利于基因高效轉移和長期表達；容量大，易人工合成，缺乏自動復制載體自身的能力［１］。由于病毒基因組結構簡單、分子背景比較清楚、易于改造和操作、感染效率高、有較高靶細胞特異性，這些都是其他載體系統無法比擬的，而慢病毒載體由于其對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力且轉染效率高、靶向性好和持久性表達等特點，病毒載體系統就顯得格外引人注目。

1 慢病毒及其載體的簡介

慢病毒屬于逆轉錄病毒科，為RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆轉錄病毒gag、pol和env3個基本結構基因外，還包含4個輔助基因vif、vpr、nef、vpu和2個調節基因tat和rev［２］。慢病毒載體（Lentiviral vector， LV）作為外源基因載體，其產生均包括一個遺傳割裂基因表達的設計。病毒元件要符合以下條件：①慢病毒組裝輔助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒轉基因載體RNA包括轉基因表達盒；③異質糖蛋白。目前使用不同種屬來源的慢病毒載體，包括來源于人類（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、貓（FIV）等其它物種［３］。

2 病毒載體的構建

由于慢病毒的一些自身因素，我們需對其進行以下的一些改建，使其可以更好地為疾病治療和科研工作服務。

2.1 最小輔助包裝元件

為了減少病毒序列的數量從而減少同源重組的風險，去除了組裝慢病毒載體結構中不同輔助元件或用其它的特異序列來代替。其中包括原位癌激活基因序列的調整。另外，去掉附加或調節基因與gag-pol基因一樣，已在一些慢病毒載體設計中得以應用［４］。

2.2 去掉附加基因

有幾個HIV-1基因（vif，vpr，vpu，nef）對體外病毒復制不重要，但對體內病毒的致病性非常重要，甚至nef，vif，vpr整合在病毒顆粒內從而促進了載體的免疫原性。因此缺乏這些非重要基因時能夠有效生產慢病毒載體是非常重要的［５］。然而，有研究表明在駐留型巨噬細胞和活性Ｂ淋巴母細胞的轉導中需要nef，vif，vpr的參與［６］。因此，在去掉附加基因的過程中，要依具體情況決定基因的去留。

2.3 去除調節基因

有研究表明反式作用元件tat對全效慢病毒載體基因組RNA中的5-LTR的tat依賴性U3序列已經被強效啟動子序列取代。在安全性方面，通過在分散結構中進一步分裂原病毒基因組來表達rev。在設計雙順反子gag-pol，IRES，rev組裝表達結構時也表達了rev基因結構。載體與rev效應元件（RRE）相互作用并影響了非剪接gag-pol mRNAs和轉基因載體基因組RNA從核內輸出。RRE序列已被異種病毒序列所取代，此種病毒序列能促進非剪接轉錄產物從核中輸出或促進非剪接轉錄產物的穩定性。用這些異種輸出序列取代RRE/rev引起了HIV-1或SIV載體效價的下降［７］。另外，實驗表明宿主細胞因子參與了RRE包含的RNAs從核中輸出的過程。

2.4 殼體化位點的最低要求

在大多數慢病毒載體殼體化位點要求在轉移載體RNA中存在gag基因區的最小5'-片段，此片段含有對順式組裝活性有必要的主干環結構。在大多數慢病毒載體體系中，包含在N-末端片段落gag ORF，大約有300~400個堿基對，已經被移碼突變截斷，因此易感呈現gag肽的轉錄/翻譯不會干預轉基因的轉錄/翻譯［８］。

3 慢病毒載體在疾病治療方面的應用

慢病毒載體在基因治療方面已取得了良好的效果，國外已經進行了一系列的從基礎到臨床的系統研究工作，包括構建有效載體所需的最少的HIV-1基因、SIN載體的構建、應用HIV-1載體包裝細胞系、非人類慢病毒載體的應用等；尤其是在安全性方面，在用H1V-1為載體的體內及體外實驗中，迄今尚未發現誘發宿主免疫反應的產生，表明其安全性是有保證的。

3.1 腫瘤治療

大約30%的乳腺癌中有表皮生長因子受體家族蛋白HER₂的過表達，HER₂表達水平與病人的預后以及惡性程度密切相關。在以往鑒定的對HER₂有良好RNAi效應的靶序列的基礎上，構建了一系列U₆和H雙啟動子小干擾RNA（siRNA）表達載體［９］，并轉染HER₂高表達乳腺癌SKBR3細胞定量測定了其HER₂下調效應。程連勝［１０］等做siRNA表達盒經LR重組反應被克隆入慢病毒載體中并成功包裝成病毒的實驗。由于siRNA是作用于mRNA上并導致其降解的，采用熒光定量PCR對感染siRNA慢病毒后乳腺癌SKBR₃細胞HER₂的mRNA水平進行了相對定量、蛋白印跡雜交和流式細胞儀等一系列實驗證明：慢病毒介導的RNAi確實能有效地下調腫瘤抗原HER₂的表達，結果顯示，由于HER₂下調導致了細胞生長抑制。由此可見，用慢病毒介導的RNAi對乳腺癌的治療將有良好的應用前景。

自身分泌活動因子（AMF）是由腫瘤細胞分泌的，并且促進腫瘤細胞的生長。AMP和其受體（AMPR）的表達與許多低成活率和進行性的胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、食道癌、皮膚惡性黑色素瘤和肺腺癌有著密切的關系［１１-１７］。最近有研究表明，AMP的突變對乳腺癌的進展和轉移有著明顯的促進作用。AMP表現出了與磷酸葡萄糖異構酶的一致的序列，它受小窩蛋白-1（Cav-1）的負向調節［１８］。Kojic［１９］等用慢病毒載體轉導Cav-1基因到乳腺癌細胞中，實驗結果表明，AMP的表達與Cav-1的表達有著明顯的負相關性，Cav-1對AMP有強負調節作用，對癌細胞的生長有抑制作用。由此可推斷，慢病毒載體介導的Cav-1對與AMP表達相關的惡性腫瘤應該有一定的治療效果。

3.2 血液系統疾病的治療

慢病毒載體不僅能感染造血干細胞（HSCs），使攜帶的目的基因整合至HSCs基因組內，且能利用病毒攜帶的調控元件，使目的基因隨HSCs細胞特異性表達。Michel Sadelain［２０］等用小鼠模擬了人α-地中海貧血的模型，并用慢病毒載體介導治療基因進行治療。實驗載體來源于TNS9 vector，這個載體已表現出良好的轉移治療用的人類β-globin基因進入小鼠造血干細胞的能力［２１-２４］。對α-地中海貧血，除了將β-globin基因用α-globin基因替代外，原載體的原件都保留，將載體通過小鼠卵黃囊的血管直接注射進胚胎，但是轉移進去的基因在表達過程中出現了衰減現象［２０］，原因還有待于研究。但在對β-地中海貧血的治療中，慢病毒介導的β-globin基因進入小鼠的造血干細胞卻取得了不錯的效果［２５］。雖然慢病毒載體在地中海貧血治療中不盡完美，但可以肯定的是，隨著研究的深入，慢病毒載體在地中海貧血中的應用一定會有光明前景。

3.3 半月板的修復

張經緯等［２６］用ViraPower慢病毒載體系統轉載中堿性成纖維細胞生長因子，研究其在新西蘭大白兔的半月板纖維軟骨細胞損傷修復作用，結果發現轉染48h后半月板細胞培養液中堿性成纖維細胞生長因子就有明顯的表達；細胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的時間較對照組和空白組縮短，并且膠原合成結果顯示實驗組細胞膠原高于對照組和空白組。表明利用慢病毒轉基因技術能有效地將堿性成纖維細胞生長因子基因轉染入半月板纖維軟骨細胞，繼而促進半月板細胞的增殖和基質合成，有可能為治療半月板損傷提供新的方法。

總之，盡管慢病毒載體目前還不盡完善，仍然存在很多的問題，但是由于慢病毒載體可轉染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應、安全性好等優點，對轉基因的治療和研究有很大的誘惑力。相信隨著技術的進步，該類載體將會得到進一步提高，并具有廣闊的應用前景。

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（責任編輯：姜付平）