麻蠅全蛋白分析及凝集素的純化與鑒定

摘要以麻蠅成蟲為材料，利用溶解度的不同，分別用硫酸銨、氯化鈉、乙醇、氫氧化鈉從脫脂麻蠅粉中分離、純化獲得清蛋白、小分子肽、球蛋白、醇溶蛋白和堿溶性蛋白等幾類蛋白。測定蛋白質(zhì)含量，并用親和層析法純化凝集素，通過SDS—PAGE凝膠電泳測定各類蛋白的相對分子質(zhì)量。結(jié)果表明:脫脂麻蠅粉蛋白質(zhì)的主要成分是清蛋白、球蛋白和小分子肽;蛋白質(zhì)得率為44.94%，回收率為85.6%，凝集素的相對分子質(zhì)量為82.9KD，血凝活力效價為1/104。

關鍵詞麻蠅全蛋白凝集素

中圖分類號:Q96文獻標識碼:A

麻蠅是雙翅目麻蠅科昆蟲。據(jù)國內(nèi)外對蠅蛆營養(yǎng)成分的分析顯示，蠅蛆含粗蛋白59%～65%，超過糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)與世界衛(wèi)生組織(WHO)提出的參考值(40%);其必需氨基酸與非必需氨基酸總量的比值(E/N)為0.78，超過FAO與WHO提出的參考值(0.6)，還含有10%-16%的脂肪，8%-10%的甲殼素和多種維生素、微量元素等營養(yǎng)成分，是一種重要的飼料蛋白資源。VanderKnaap等人認為凝集素能夠結(jié)合細菌細胞壁上的糖鏈結(jié)構，從而使細胞破壁，達到殺滅細菌細胞的作用。而且蠅蛆中的抗菌物質(zhì)等活性蛋白質(zhì)還有不同的重要藥用價值。

目前，在昆蟲蛋白質(zhì)的提取制備方面，對蠶蛹、家蠅進行了一些研究，而麻蠅的全蛋白分析則很少，為此，本研究對麻蠅成蟲蛋白質(zhì)的提取制備方法和工藝參數(shù)等進行研究，并對麻蠅全蛋白分析及凝集素的純化與鑒定，目的是為更進一步地規(guī)模化開發(fā)和利用蠅蛆打下基礎，也對其它昆蟲的蛋白質(zhì)分析起到一定的借鑒作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

麻蠅的成蟲(江西思達生物技術有限公司提供);兔血取自新西蘭大白兔(南昌大學動物研究所提供)。試劑:標準蛋白Marker，瓊脂糖凝膠-4B，牛血清白蛋白，丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、甘氨酸、硫酸銨等。儀器:索式提取器，紫外分光光度計，垂直板電泳儀，高速離心機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻蠅成蟲的處理

(1)將成蟲烘干，并粉碎成粉末狀(過180目篩)。(2)索氏脂肪抽提法浸提麻蠅油脂:用濾紙將4g粉末分批包好，放入索式提取器內(nèi)用石油醚抽提脂肪。4h后，脂肪已提取完全，并將抽提后的蠅粉烘干、冷卻、稱重、計算。抽脂后的麻蠅粉待用。(3)取1.2g抽脂后的麻蠅粉，加入20ml緩沖液攪拌均勻，在4℃下提取10h，用勻漿器勻漿后，再12000r/min離心15min，得上清液及剩余物，將剩余物重復上述操作。合并兩上清液，得上清液26ml。取0.5ml上清液，用Bradford檢測法測其蛋白質(zhì)含量(所制作標準曲線見圖1)。其余上清液和剩余物備用。

1.2.2 麻蠅成蟲各蛋白組分的制備及其含量測定

(1)清蛋白和小分子肽(硫酸銨沉淀)。取25ml上清液，以鹽析溫度、pH值、硫酸銨濃度和時間為實驗因素，采用L25(54)正交法進行實驗(表1)，以所得蛋白含量為指標，確定最佳工藝參數(shù)。

按表2加入硫酸銨至所需濃度，調(diào)pH值，在一定溫度條件下鹽析一定時間，離心，沉淀即為清蛋白，上清用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮得小分子肽，測其蛋白含量。

(2)球蛋白。在經(jīng)過蒸餾水提取后的剩余物中加入10%的氯化鈉攪拌，靜置，離心，取上清液，重提3次合并上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，測其蛋白含量。

(3)醇溶蛋白、堿溶蛋白和難溶蛋白。在經(jīng)過氯化鈉提取后的剩余物中依次加無水乙醇，2%的NaOH，提取和測定方法同(2)，分別提取醇溶蛋白、堿溶蛋白和難溶蛋白，并分別測定其含量。所得殘渣烘干稱重。

上述所得蛋白全部用葡聚糖凝膠G-10過濾后放入透析袋中，用聚乙二醇6000濃縮到適當濃度備用。

1.2.3 麻蠅凝集素的純化

(1)凝集素的純化方法。取約10g新鮮成蟲加入昆蟲緩沖溶液(BIS)和少量的苯硫脲充分研磨，于4℃離心，重復3次，除去上層漂浮的脂肪層，保留上清液。將上清液與Sepharose-4B混合3h后裝柱，用BIS以1ml/min的流量洗脫雜蛋白，至280nm吸光度小于0.02時停止，用0.2mol/L的D-半乳糖解吸，流量為1ml/min，收集吸收峰，并將層析后的溶液裝入透析袋中透析，脫鹽后凍干，得淡黃色凝集素，備用。

(2)血凝活力(HA)的測定。在V形血凝板上，用PBS緩沖液0.5ml對己純化的麻蠅凝集素0.5ml進行倍比稀釋，每管分別加入2%血球懸液0.5ml，振蕩1min，在室溫靜置1h，顯微鏡觀察凝血現(xiàn)象，測定其效價。效價定義為:最后一個發(fā)生可見凝集反應的樣品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定麻蠅成蟲各蛋白組分和凝集素。

電泳實驗步驟:取適量上述所制取各蛋白組分和凝集素，參照《蛋白質(zhì)技術手冊》進行。其中分離膠濃度為15%，堆積膠濃度為5%，開始電壓80V，進入分離膠后電壓調(diào)至160V，至溴酚藍距離凝膠底部1cm時停止，用R-250染色。電泳圖譜見圖2。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨沉淀最佳工藝參數(shù)的篩選

由正交實驗(表2)可知，硫酸銨濃度對麻蠅成蟲鹽析所得蛋白量影響最大，其它條件依次為pH值、溫度、時間，因此因素主次關系為C>B>A>D。而且溫度、pH值、硫酸銨濃度、時間的最大均值分別為均值1、均值1、均值3、均值4。因此，鹽析的最優(yōu)組合為A1B1C3D4，即麻蠅成蟲蛋白提取工藝的參數(shù)以溫度4℃、pH4、硫酸銨濃度70%、時間7h所提取的蛋白得率最高。

2.2 蠅蛆蛋白各組分含量的分析

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的性質(zhì)，可將麻蠅成蟲蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、堿溶蛋白和難溶蛋白。各蛋白組分的分布情況見表3。由表3可知，脫脂成蟲粉中的蛋白質(zhì)以清蛋白、小分子肽、和球蛋白為主。脫脂成蟲粉中的蛋白含量為52.5%，而提取出的各類蛋白總量為44.94%，脂肪含量為12.75%，可見利用溶解度不同的方法從脫脂麻蠅成蟲粉中提取蛋白的提取率可達到85.6%。

2.3 麻蠅成蟲各蛋白組分和凝集素的分析

圖2中從右到左分別為蛋白質(zhì)標準量、凝集素、醇溶蛋白、堿溶蛋白、難溶蛋白、球蛋白、清蛋白和小分子肽的電泳圖。由圖2可以看出，本試驗所得麻蠅成蟲主要蛋白的分子量為84KD，還有少部分蛋白質(zhì)的分子量為32-66.2KD。凝集素由三個亞基組成，分子量分別為34.9KD、29.4KD、18.6KD，血凝活力的效價為1/104。

3 討論

本研究所得麻蠅成蟲的脂肪含量為12.75%，脫脂粉的蛋白含量為52.5%，提取的蛋白含量為44.94%，利用溶解度不同和鹽析的方法從脫脂麻蠅成蟲粉中提取蛋白的提取率為85.6%，比王芙蓉的提取率低5.11個百分點，得率的差異可能與蠅蛆的品種有關，也可能是所用的方法不同。

以硫酸銨作為蛋白質(zhì)鹽析的中性鹽，用L25(54)正交實驗確定出鹽析最佳參數(shù)為:溫度4℃、pH4、硫酸銨濃度70%、時間7h，獲得了較高的得率。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定麻蠅成蟲主要蛋白的分子量為84KD，還有少部分蛋白質(zhì)的分子量為32-66.2KD。凝集素由三個亞基組成，分子量分別為34.9KD，29.4KD，18.6KD，其血凝活力的效價為1/104。