羅格列酮對體外高糖培養乳鼠心肌細胞凋亡的影響

[摘要] 目的 探討羅格列酮對體外高糖培養乳鼠心肌細胞凋亡的影響。方法 SD乳鼠進行原代心肌細胞培養48h后，換無血清的DMEM培養基并轉移到24孔板上，隨機分為3組，分為培養心肌細胞不加入葡萄糖組，加入25mmol/L葡萄糖組，加入25mmol/L葡萄糖以及10μmol/L羅格列酮組。48h后，分別測定各組心肌細胞乳酸脫氫酶含量;四唑鹽比色法測定各組心肌細胞的生長情況及增殖活性;流式細胞儀檢測各組心肌細胞的凋亡情況。結果 與正常對照組相比較，經過羅格列酮干預后，乳酸脫氫酶含量顯著下降;四唑鹽比色結果顯示心肌細胞存活率增高;流式細胞儀檢測發現壞死細胞和凋亡細胞明顯減少。結論 羅格列酮能夠抑制體外高糖培養的乳鼠心肌的細胞凋亡。

[關鍵詞] 心肌細胞; 細胞凋亡; 損傷; 糖尿病

[中圖分類號] R587.2;R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)23-19-03

The Effect of Rosiglitazone on High Glucose on the Cardiomyocytes Apopotosis in Cultured Neonate Rat

YU Hongyu MA Chunyu

The Graduate College of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of rosiglitazone on high glucose on the cardiomyocytesapopotosis in cultured neonate rat. MethodsAfter 48 hours cultured the primitive cardiomyocytes of Sprague-Dawley neonate rats，continuing to culture them in the DMEM medium without serum，changing culture fluid，tranfering them to the 24-holl-medium，were randomLy divided into 3 equal groups:the normal control group，the 25mmol/L glucose group，the 25mmol/L glucose and the 10μmol/L rosiglitazone group. The lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes were determined. At the same time，we determine the living rate of cardiomyocytes by MMT and we observe the cardiomyocytes apopotosis with the Flow Cytometer. ResultsCompared to the normal control group，in the rosiglitazone group，the lactate dehydrogenase of the neonate rat cardiomyocytes remarkablly decreased;the cell living rate obviously increased by MMT;the necrosis and apopotosis cells obviously reduced with the Flow Cytometer. ConclusionThe rosiglitazone could inhibit the apopotosis of the cultured cells of neonate rats remarkably.

[Key Words]Cardiomyocytes; Apopotosis; Injury; Diabetes

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的一個嚴重并發癥。心肌細胞有不可再生的特點，且心肌細胞凋亡可能是導致糖尿病心肌細胞丟失及心力衰竭的重要原因之一[1]。研究糖尿病時如何對抗心肌細胞凋亡具有重要意義，因此找到抑制心肌細胞凋亡發生的途徑是防止DCM發生的重要手段。

國內外臨床研究顯示，羅格列酮(rosiglitazone，RSG)可使空腹血糖(FPG)和糖化血紅蛋白(HbA1c)顯著下降，可改善血糖控制情況;同時伴有血胰島素和C肽水平降低，也可使餐后血糖和胰島素水平下降;其對血糖控制的改善作用較持久。唐曉紅[2]等研究發現RSG能夠使高糖刺激下的腎小管上皮細胞凋亡減少，并且有明顯的時效關系。但RSG對體外高糖培養的心肌細胞是否具有抑制凋亡的作用報道較少。本實驗擬在體外模擬糖尿病時體內高血糖環境，并研究RSG對高糖環境的心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Sprague-Dawley乳鼠，出生1～3d，雌雄不拘，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要實驗試劑及儀器 DMEM培養基(Sigma公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)，XD-101型倒置顯微鏡(Olympus Tokyo JAPAN)，流式細胞儀(BD Facscalibur USA)，二氧化碳孵箱(Sheldon Manufacturing Inc USA)，羅格列酮原粉劑(史克必成天津制藥有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞的培養 在無菌的條件下，取出生2～3d的SD乳鼠，開胸取出心臟。用D-Hanks液沖洗三次后剪成約1mm³大小的碎片，加入0.08g/L胰蛋白酶消化細胞。取消化完畢后的細胞，加入體積分數為15%的小牛血清，84%的DMEM培養基，接種并于CO₂孵箱常規培養48h。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 將上述細胞轉移到兩個24孔板上，隨機分為3組，每組16孔，換培養基的同時給藥，每組給藥如下，正常對照組:正常培養心肌細胞，不加入葡萄糖;葡萄糖濃度為25mmol/L組;葡萄糖濃度為25mmol/L組+RSG10μmol/L組。給藥48h后，分別測定以下指標。

1.2.3 乳酸脫氫酶含量的測定 取培養后心肌細胞的上清液，經全自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶活力，作為判斷心肌細胞損傷程度的指標。

1.2.4 四唑鹽比色法測定心肌細胞生長及增殖活性 各組細胞于測試前4h，每孔加入2mg/mL的MTT液(50μl/孔);于CO₂孵育箱中繼續培養4h后棄去培養液，每孔加入DMSO 0.15mL，充分振蕩10min后使結晶充分溶解，上酶標儀檢測570nm波長處各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.5 流式細胞儀檢測培養心肌細胞的凋亡率 流式細胞儀采用FITC- Annexin- V/PI雙染法進行細胞凋亡檢測分析，流式細胞儀激發光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC(異硫氰酸熒光素)熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI(碘化丙啶)熒光。

將心肌細胞培養48h后用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，并調整細胞密度為1×106g/L，制成單細胞懸液，直接收集到10mL的離心管中，每樣本細胞數為(1～5)×106/mL，1000r/min離心5min，棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，1000r/min離心5min。用100μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15min。1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，可同時描述三群不同狀態細胞:左下象限FITC-/PI-細胞，即正常活力細胞;右下象限FITC+/PI-細胞，即凋亡細胞;右上象限FITC+/PI+細胞，即已死亡細胞。

1.3 統計學分析

實驗數據計量資料用均數±標準差(χ±s)表示，采用SPSS12.0統計軟件進行多組間單因素方差分析，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組乳酸脫氫酶含量及四唑鹽比色法結果

高糖刺激下，乳酸脫氫酶含量明顯增高，心肌細胞存活率明顯下降，而經過羅格列酮干預后，乳酸脫氫酶含量下降，心肌細胞存活率明顯增高，各組之間比較具有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

2.2 流式細胞儀檢測結果

從流式細胞儀的雙變量散點圖上可以看出，正常對照組僅有少量的壞死細胞和凋亡細胞;葡萄糖25mmol/L組可見較多的凋亡細胞和壞死細胞;而經過羅格列酮干預后，壞死細胞和凋亡細胞明顯減少，但與正常對照組相比較，仍有一定的差異。見圖1、2、3。

3 討論

心肌細胞凋亡是產生糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的基礎。而判斷心肌細胞凋亡一般采用測定心肌細胞內含量較多的酶類、四唑鹽比色法測定心肌細胞生長及增殖活性、流式細胞儀檢測等方法。本研究顯示，體外培養的高糖干預下的心肌細胞內乳酸脫氫酶含量增高，四唑鹽比色法結果顯示心肌細胞存活率降低，流式細胞儀檢測顯示高糖培養下，壞死和凋亡的心肌細胞明顯增多。這些均說明高糖環境對體外培養的乳鼠心肌細胞具有促進凋亡的作用，同時也為后續進行藥物干預的研究打下了前期基礎。

而羅格列酮(rosiglitazone，RSG)對體外高糖環境下心肌細胞培養的干預后，LDH含量顯著下降;四唑鹽比色法結果顯示心肌細胞存活率顯著升高;流式細胞儀檢測的心肌壞死細胞和凋亡細胞明顯減少。說明RSG在體外高糖環境下對心肌細胞的培養具有抑制乳鼠心肌細胞凋亡的作用。進而可以提示RSG對體外高糖培養的乳鼠心肌細胞具有保護作用。

噻唑烷二酮類藥物有抑制細胞凋亡、增殖的作用[3]。RSG是其代表性藥物，它是一種新型的胰島素增效劑，通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxisome proliferators activated receptor-γ，PPAR-γ)而顯著改善2型糖尿病患者的胰島素抵抗，高胰島素、高脂血癥、高血糖癥而廣泛應用于臨床。但其保護心肌細胞的作用可能存在其他機制:在體外實驗中已證明RSG可以通過降低內皮素-1(endothelin-1，ET-1)的濃度而抑制心肌肥大[4]。大鼠心肌細胞有內皮素特異性受體，在培養新生大鼠心肌細胞中，ET-1可誘導心肌肥大、增加蛋白質的合成，是引起心肌肥大的因子[5]。而RSG可能減少了隨后Na+/H+交換和Na+/Ca2+交換的激活，抑制鈣的內流，減輕細胞的鈣超載，進而抑制了ET-1引起的心肌肥大[6]。RSG還可以降低心肌細胞丙二醛含量，說明RSG可以抑制脂質過氧化的作用，即RSG在高膽固醇血癥中保護心肌細胞的損傷可能與抗氧化作用有關[7]。此外RSG是胰島素的增敏劑，胰島素對心肌細胞的損傷有保護作用[8]，因此RSG如果在體內抑制心肌細胞凋亡的作用將會進一步加強。以上機制只是對RSG抑制心肌細胞凋亡的探討，其確切機制尚需以后的實驗進一步證實。

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(收稿日期:2009-03-25)