各類葛根中葛根素的成份分析

摘要：目的建立不同品種葛根中葛根素及總黃酮的含量測定方法。方法采用RP-HPLC法，以甲醇－水(32:68)為流動相，檢測波長為250nm測葛根素含量，紫外分光光度法測柴葛、粉葛中總黃酮含量。結果葛根索峰分離度提高，峰形改善；葛裉素0.204～2.04ug范圍內與峰面積線性關系良好(r=0.9999)，回收率為98.7％(n=5)，精密度RSD=0.86％。總黃酮濃度在4.08～16.32ug／ml范圍內與吸收度線性關系良好(r=0.9998)。結論該法靈敏、準確、簡便易行，重復性好，可用于中藥葛根藥材及飲片的質量控制。

關鍵詞：葛根 葛根素 含量 分析

0 引言

葛根為豆科植物柴葛和甘葛藤的干燥根，前者習稱柴葛，甘葛藤習稱“粉葛”，始載于《神農本草經》，味甘、辛，性平，具有增加腦及冠狀動脈血流量、降低血管阻力、收縮平滑肌、降血糖及解熱等多種功效。民間用于治療傷寒、溫熱頭痛、煩熱消渴等癥，也是中醫常用的祛風解毒藥。現代研究表明，葛根含葛根異黃酮，主要為葛根素、大豆苷、大豆苷元3種活性成分，其中葛根素是本屬的特征成分，也是主要成分，為了對葛根進行有效的質量控制，本實驗以葛根素為指標，以柴葛、粉葛藥材為對象，建立了高效液相色譜法測定其葛根素的含量方法，并采用紫外分光光度法對其中的總黃酮進行了含量測定，為柴葛、粉葛的藥材鑒定提供參考方法。

1 儀器與材料

1.1儀器美國Waters公司600-2487高效液相色譜儀，Mil－lenium數據處理系統；Waters2487紫外檢測器.島津UV-2401 PC型紫外分光光度計；島津AY120型萬分之一電子分析天平；SB3200型超聲清洗器。

1.2材料葛根素對照品：中國藥品生物制品檢定所，甲醇為色譜純：水為重蒸餾超純水；其它試劑均為分析純。柴葛產于安徽岳西，粉葛產于廣西。

2 方法與結果

2.1HPLC法測定葛根中葛根素的含量

2.1.1色譜條件色譜柱：Zorbax XDB-C18(4.6mm×250mm，5um)；流動相：甲醇－水(32:68)；流速1ml／min；檢測波長250nm；柱溫22℃；進樣體積10ul。理論板數按葛根素峰計算不低于5000。在該色譜條件下，樣品中的葛根素與其它峰均能達到基線分離，保留時間在14.3min左右。

2.1.2對照品溶液的制備精密稱取葛根素對照品5.1mg，甲醇定容于25ml量瓶。分別移取0.5，1.0，2.0，2.5ml于5ml量瓶，水定容，與原液共同作為HPLC用對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備熱回流提取法：精密稱取柴葛、粉葛粉末(過50目篩)各0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，稱重。回流提取30min，放冷，稱重并以30％乙醇補足減失重量，搖勻過濾，取續濾液為供試品，待測。

索氏提取法：稱取柴葛、粉葛粉末各0.5g，精密稱定，以甲醇為提取劑提取4h，過濾，濃縮提取液并用甲醇定容于10ml量瓶。超聲處理30min，取上清液以水定容于10ml量瓶，待測。

2.1.4線性關系考察取對照品溶液，按照色譜條件進樣10ul，葛根素進樣量X(ug)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為：Y=3.5076×106X+3.2745×104，r=0.9999。結果表明，葛根素進樣量在0.204～2.04ug范圍內與峰面積線性關系良好，可用外標兩點法計算含量。

2.1.5精密度考察在色譜條件下，吸取同一對照品溶液10ul，連續進樣5次，測得峰面積，RSD=0.8％，表明進樣與峰面積積分的精密度良好。

2.1.6重復性考察取同一批柴葛、粉葛樣品5份，按外標法計算含量，RSD=2.8％，表明分析方法重復性良好。

2.1.7穩定性考察精密吸取對照品溶液10ul，分別在0，1，2，4，8，12，24，48h時進樣，在色譜條件下測定峰面積，其RSD值為1.4％。表明葛根素在室內正常條件下48h內穩定，因此整個實驗過程可以在常溫不避光的條件下操作。

2.1.8回收率考察精密稱取已知葛根素含量的同一樣品藥材粉末5份，20mg／份，精密稱定后，每份加入濃度為0.204mg／ml的對照品溶液2.5～3.3ml，按“供試品溶液制備”項下操作，精密吸取10ul，進樣，計算回收率。

2.1.9樣品測定按“供試品溶液制備”項下操作，制備各樣品溶液，精密吸取10ul，進樣，在所選色譜條件下測定，外標兩點法計算含量。

2.2紫外分光光度法測定葛根中總黃酮含量

2.2.1線性關系考察精密稱取葛根素對照品5.1mg，甲醇定容于25ml量瓶。移取0.2，0.4，0.5，0.6，0.8ml置于10ml量瓶，水定容，為紫外測總黃酮用對照品溶液。

以溶液濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，得線性方程：Y=0.078X+0.01 52，r=0.9998。表明總黃酮濃度在4.08～16.32ug／ml范圍時與吸收度線性關系良好。

2.2.2供試品制備方法1：分別稱取柴葛、粉葛4.5g，置于圓底燒瓶，乙醇回流提取3次，40ml／次，時間均為1h。合并3次濾液并濃縮置25ml量瓶，乙醇定容。取1ml用乙醇定容于100量瓶，再取1ml上清液于10ml量瓶，水定容，待測。以1ml乙醇加水定容于10ml量瓶中為空白對照。

方法2：取上述液相用索氏提取法制得的待測品0.4ml，置于10ml量瓶，水定容，待測。

2.2.3吸收波長考察與樣品測定在200～800nm間紫外掃描濃度為8.6ug／ml的葛根素對照品溶液。在249～251nm處有最大吸收，選用250nm測定。分別測定兩種方法制得4個樣品。

3 討論

HPLC法對不同產地的柴葛、粉葛中的葛根素的含量進行了測定，表明柴葛中葛根素含量約為粉葛的3倍，紫外測總黃酮含量表明，柴葛中葛根素量占總黃酮量的55％左右，粉葛中葛根素量占其總黃酮量的48％左右。同時比較了不同提取方法對葛根素和總黃酮含量測定的影響，發現回流提取法得到的葛根素含量較高，更有利于其提取。

在葛根素的提取中使用體積分數為30％的乙醇，是通過實驗與參閱文獻得出的結果。此時總黃酮中的酚羥基主要以離子形式存在，HPLC色譜圖為單峰，而使用60％乙醇提取時，總黃酮中酚羥基以離子與分子形式共存，色譜圖為雙峰。

葛根素HPLC圖譜中葛根素峰易拖尾，分離度低，本文研究了甲醇：水不同配比對峰形、分離度和保留時間的影響，體積比為25:75時葛根素峰拖尾，與后面的小峰分離度為1.3，體積比為35:65時葛根索峰與前峰易重合。甲醇:水比(VA／)為32:68時，在樣品分析中葛根素與其它峰均能達到基線分寓，保留時間適中，柱效高，故選用為流動相。

此外，比較柴葛與粉葛的圖譜，可發現其在葛根素及其它成分上均存在較大差別。

本實驗比較了不同提取方法對不同品種葛根中葛根素及總黃酮含量測定的影響，建立了HPLC法測定柴葛、粉葛中葛根素及UV法測其總黃酮含量的方法。方法學考察表明，該法準確、靈敏、簡單、快速，可作為葛根中藥材及飲片質量控制的方法之一。