切應力對人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響

孫　陽　易　蔚　魏旭峰　易定華　郭樹忠

[摘要]目的：探討切應力作用于人骨髓間充質(zhì)干細胞(HMSCs)后，對細胞增殖的影響。方法：將HMSCs種植于平板流動腔中，待貼壁后對其施加1dyne/cm2的切應力作用6h，用MTT法測細胞增殖曲線，并用流式細胞儀測定細胞周期，計算增殖指數(shù)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)HMSCs在1dyne/cm2切應力作用6h后，增殖曲線抬高，G2+S期細胞明顯增加。結(jié)論：HMSCs在切應力作用下，增殖能力增強，是組織工程血管種子細胞的理想選擇。

[關鍵詞]切應力；骨髓間充質(zhì)干細胞；增殖；細胞周期

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0325-03

Shear stress stimulates mesenchymal stem cells proliferation

SUN Yang1, YI Wei2, WEI Xu-feng2, YI Ding-hua2, GUO Shu-zhong1

（1.Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital； 2. Department of Cardiovascular Surgery. The Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi,China）

Abstract：Objective To discover the effect of fluid shear stress on the proliferation of human mesenchymal stem cells (HMSCs). Methods HMSCs were cultured on the bottom of the flow chamber for 1 day before exposure to fluid shear stress，and then exposed to 1 dyne/ cm2 shear stress for 6 h. We can acquire the proliferation curve by means of MTT and gain the cell cycle and cell proliferative index. Results Discovered that under the action of 1 dyne/cm2 shear stress for 6 h, HMSCs improved their capability of proliferation. Conclusion HMSCs gain better ability of proliferation after exposure to shear stress, and they are promising seed cells in the field of tissue engineering blood vessels.

Key words：shear stress; human mesenchymal stem cells;proliferation; cell cycle

臨床工作中常會遇到患者血管損傷，而自體血管取材受限的問題，異體血管存在免疫排斥反應，人工血管又容易導致血管栓塞，因此，人們對組織工程血管給予了更多關注。內(nèi)皮細胞作為組織工程血管種子細胞，取材受限，且無法發(fā)揮理想的生物學功能。骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）具備增殖能力強，具有多向分化潛能，可逃避機體免疫監(jiān)視，取材方便，易于體外培養(yǎng)擴增等優(yōu)點，受到組織工程血管研究的關注。MSCs作為組織工程血管的種子細胞，當其植入體內(nèi)后必然要面臨血液流體切應力的考驗，已有研究表明流體切應力可促進血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞及成骨細胞等的增殖[1-3]，高切應力作用亦可促進MSCs的增殖[4]，但低切應力作用較短時間（30min）可促進MSCs向成骨細胞分化，卻不能明顯促進MSCs的增殖[5]。那么，低切應力作用于MSCs較長時間后，對其增殖會產(chǎn)生怎樣的影響，目前尚未見報道。本實驗對人骨髓間充質(zhì)干細胞（HMSCs）施加1dyne/cm2切應力作用6h后，觀察細胞增殖的情況，了解低切應力作用于HMSCs較長時間后對其增殖的影響，探討在低切應力作用下培養(yǎng)HMSCs是否更利于促進其增殖。

1材料和方法

1.1 HMSCs的分離與培養(yǎng)：取人髂骨骨髓（來自志愿者），PBS稀釋后溶液以300g/min的速度離心5min。棄上清液，再用培養(yǎng)基重懸沉淀，加入到梯度Percoll（Sigma）液中，以900g/min的速度離心20min。吸取交界面白膜層，用PBS重懸細胞后，以300g/min的速度離心5min，再用含10％FBS（Gibco）的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基重新懸浮細胞，300g/min離心5min后，棄上清液。加少量含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹勻后置于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。24～48h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞。5～6天消化分瓶傳代培養(yǎng)。

1.2 HMSCs表面抗原的鑒定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收獲第3代細胞，其分別與抗CD29，CD34，CD45（均購自SantaCruz公司）的單克隆抗體飽和溶液在室溫下反應30 min，然后用PBS洗滌2次，再與FITC標記的二抗避光作用15min。最后用PBS洗滌并重懸于PBS中，對HMSCs表面抗原進行流式分析。

1.3 HMSCs誘導分化為脂肪細胞能力鑒定：誘導脂肪細胞的培養(yǎng)基由1mM右苯丙胺(Sigma)、0.5mM 3-異丁甲基黃嘌呤(Sigma)、0.1mM吲哚美辛(Sigma)及10mM胰島素組成，HMSCs在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，用10%的甲醛（Sigma）固定1h。然后用60%異丙醇洗滌，再用油紅O染色10min。

1.4 HMSCs誘導分化為成骨細胞能力鑒定：誘導成骨細胞的培養(yǎng)基由胎牛血清（Gibco）、10-7M地塞米松（Sigma）、0.15mM維生素C (Sigma)及2mMβ-磷酸甘油(Sigma)組成，HMSCs在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后，用多聚甲醛（Sigma）固定。然后在固定后爬片上作骨鈣素(B＆D)免疫組化染色，以鑒定所培養(yǎng)的HMSCs是否具備分化為成骨細胞的能力。

1.5 剪切力作用：將經(jīng)過鑒定的HMSCs種植于平板流動腔內(nèi)（寬2.5cm,高0.05cm，長10cm），置入37℃培養(yǎng)箱24h后，將平板流動腔兩端接動力裝置管道（體外循環(huán)D型管道），動力裝置（Cobe體外循環(huán)機,購自美國）置于培養(yǎng)箱外。調(diào)節(jié)速度至500ml/min, 6h后取出平板流動腔，收集細胞樣本。

1.6 剪切力的計算：根據(jù)公式τ＝Qη/Sh，τ為剪切力大小，Q為流量500ml/min，η為含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基粘滯系數(shù)0.013Pa·s（37℃），S為平板流動腔的橫截面積0.125cm2, h為高度0.05cm，計算得τ為1dyne/cm2。

1.7 MTT法測定細胞增殖曲線：1dyne/cm2切應力作用于平板流動腔中的HMSCs6h后，分別用胰酶消化切應力作用前(對照組)和作用后（實驗組）的細胞，計數(shù)后種植于96孔板中，待24h細胞重新貼壁后，實驗組和對照組各選5孔, 每孔加入20μlMTT,4h后吸除培養(yǎng)基及MTT，再加入二甲基亞砜150μl，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定兩組細胞在490nm波長處光吸收值。連續(xù)測定7天。