腺病毒與慢病毒載體對人脂肪間充質干細胞轉導效率及基因表達的差異

李　丹　喬　群　王曉軍　錢建平

[摘要]目的:比較重組腺病毒、慢病毒載體介導增強型綠色熒光蛋白對體外培養的人脂肪來源干細胞(hADSCs)的轉導效率和外源基因表達差異。方法:原代分離培養hADSCs并鑒定，應用Ad5F35-EGFP及LV-EGFP以MOI=0、25、50、100、200、400、800 感染hADSCs，在1、3、7、14、21天應用熒光顯微鏡、流式細胞儀觀察檢測表達EGFP細胞陽性率。MTT法檢測轉導對hADSCs增殖的影響。Von Kossa染色、油紅O染色檢測體外誘導轉導EGFP的hADSCs向成骨及成脂方向分化能力。結果:hADSCs細胞表面標記CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR陰性，CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166陽性。熒光顯微鏡觀察Ad5F35-EGFP 感染hADSCs后（1～7天）可見EGFP高表達，此后逐漸減弱；LV-EGFP感染hADSCs后21天，仍可見EGFP高表達。流式細胞儀檢測Ad5F35-EGFP、LV-EGFP對hADSCs轉導效率與MOI值呈正相關。MTT顯示Ad5F35-EGFP在高MOI值（800）檢測A值與對照組相比差異顯著（P<0.01）。轉導EGFP的hADSCs經體外誘導14天可向成骨、成脂方向分化。結論:與腺病毒相比，慢病毒能夠更為安全、有效地感染體外培養hADSCs，并長期表達外源基因，是研究基因修飾hADSCs的理想載體。

[關鍵詞]人脂肪間充質干細胞；基因治療；腺病毒；慢病毒

[中圖分類號]Q343.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0342-04

Transduction of human adipose tissue-derived stromal cells using lentiviral vector and adenoviral vector: a comparative study

LI Dan，QIAO Qun，WANG Xiao-jun，QIAN Jian-ping

（Plastic & Aesthetic Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Beijing 100032，China）

Abstract： Objective To compare the efficiency of human adipose tissue-derived stromal cells (hADSCs) transduced by adenoviral vector and lentiviral vector. Methods Adipose tissues were isolated to obtain hADSCs. Ad5F35-EGFP and LV-EGFP were constructed and transduced hADSCs at multiple of infection MOI ranging from 0,25,50,100,200,400,800. At 1,3,7,14,21d post transduction,EGFP positive was detected by fluorescence microscopy and flow cytometry (FCM), which was followed by cell proliferation determination assessed with MTT assay at different MOIs. After induction of hADSCs modified with EGFP, von Kossa staining and red oil O staining were performed to test the formation of calcium and oil concentration. Results hADSCs's marker CD31,CD34,CD45,CD106 and HLA-DR were negative,CD29,CD44,CD49d,CD105,CD166 were positive. Fluorescence microscopy detected high EGFP. signal with hADSCs at 1d to 7d after infection by Ad5F35-EGFP and high EGFP signal with hADSCs at 21d after infection by LV-EGFP.FCM results showed that MOI of Ad5F35-EGFP and LV-EGFP enhanced transduce efficiency of hADSCs in a dose-dependent manner. MTT assay showed that Ad5F35-EGFP( MOI=800) A had great contrast with control group（P<0.01）. ADSCs encoding EGFP after differentiation into adipogenic and osteogenic lineages after lentiviral and adenoviral transduction. Conclusion Lentivirual vectors applied at high MOIs can result in integration and long-term gene expression.

Key words: human adipose tissue-derived stromal cells; gene therapy; adenovirus; lentivirus

脂肪間充質干細胞(Adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs) 是一類與骨髓間充質干細胞類似，具有多向分化潛功能的成體干細胞[1]。Zuk等在脂肪抽吸物中成功分離培養人脂肪間充質干細胞（hADSC），并發現其具有向脂肪、成骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞、神經細胞分化的潛能[2]。對hADSCs進行基因修飾及標記示蹤，已成為研究其分化調控機制及細胞基因治療的熱點。病毒載體系統以其較高的轉導效率和良好的靶向性在基因治療中應用廣泛，不同類型病毒載體具有各自的優缺點。本研究比較攜帶增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的梯度重組腺病毒（Adenovirus,Ad）及慢病毒（Lentivirus,LV）載體對體外培養hADSCs的轉導效率和基因表達水平，并觀察該基因修飾對hADSCs分化的影響，為進一步研究利用hADSCs進行基因治療提供實驗依據。

1材料和方法

1.1 hADSCs分離、培養擴增、細胞表面標志的檢測鑒定：脂肪組織取自在北京協和醫院整形美容外科接受腹部脂肪抽吸術的健康青年女性（5例），采取組織前均簽署知情同意書。無菌條件下，在局部腫脹麻醉下采用注射器法抽取50ml顆粒脂肪組織，靜置30min，去除上清液體，應用0.075%I型膠原酶（Sigma）37℃水浴震蕩消化30min細胞分散，應用等量含10%胎牛血清（HYCLONE）的低糖DMEM（GIBCO）中和膠原酶，800×g離心10min，重懸接種至25cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養箱中。細胞融合至70%～80%后，以0.05%胰蛋白酶/EDTA消化，1:2比例傳代[3]。細胞接種后每次換液時用倒置相差顯微鏡（Olympus）觀測細胞生長與形態變化。取培養的第3代hADSCs經過消化離心(1000r/min，5min)后細胞重懸；細胞計數后將細胞濃度調整為1×10⁸/L，分別于小鼠抗人CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD106、CD105、CD166、CD49d和HLA-DR單克隆抗體（Santa Cruse）室溫反應30min，PBS洗滌2次后于FITC標記的山羊抗小鼠Ig-G（北京中杉金橋）避光作用30min，PBS重懸細胞，應用流式細胞儀（Beckman Coulter）檢測細胞表面標志。

1.2 重組腺病毒、慢病毒載體體外感染hADSCs：本實驗應用的病毒載體均攜帶巨細胞病毒CMV啟動子調控的增強型綠色熒光蛋白( EGFP)報告基因：5型、外殼纖維為35型嵌合型重組腺病毒（Ad5F35-EGFP）滴度為9×109 pfu/ml；第三代慢病毒（LV-EGFP），滴度為2×10⁸TU/ml，由北京本原正陽基因技術有限公司提供。采用第3代hADSCs，按每孔1×105接種到24孔板中，1天后細胞貼壁，將Ad5F35-EGFP及LV-EGFP分別以感染復數（multiple of infection，MOI）=0、25、50、100、200、400、800，其中MOI=0為對照組，加入到hADSCs細胞培養液中，置于37℃、5%CO₂、飽和濕度培養箱培養12h后，培養液更換為含10%FCS的L-DMEM。

1.3 重組腺病毒、慢病毒載體對體外培養hADSCs的轉導效率及增殖的影響：病毒載體對hADSCs的轉導效率用報告基因EGFP的表達來反映。分別于感染后1、3、7、14、21天，感染細胞在倒置熒光顯微鏡（LSN 510，Zeiss）下觀察EGFP的表達，以表達EGFP細胞為陽性細胞。同時各組感染細胞分別加入0.25%胰蛋白酶消化，250μl PBS重懸后于200目濾網過濾送檢，應用流式細胞儀對各組EGFP陽性細胞率進行定量分析。MTT法觀察Ad5F35-EGFP及LV-EGFP對hADSCs增殖的影響：取感染后0、1、2、3、4、5、6、7天作為檢測點，向各孔加入MTT (Sigma) 20μl，37℃,5%CO₂培養箱內孵育3h后吸棄上清, 加入150μlDMSO(Sigma)后輕柔振蕩10min。在酶聯免疫檢測儀（Bio-rad）490nm波長下讀取光吸收值A，計算平均值并繪制生長曲線。

1.4轉基因hADSCs體外誘導分化能力檢測：病毒載體感染后第3天，各組轉導EGFP基因的hADSCs經消化以每孔3×105接種至6孔板中，待細胞融合80%時，進行體外分化誘導實驗。在倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察并攝影。

1.4.1 轉基因hADSCs向成骨細胞分化：細胞在成骨誘導分化體系即地塞米松（10-7mol/L）、β-甘油磷酸鈉（10mmol/ L）、維生素C（50mg/L）中誘導培養14天，用von Kossa染色法檢測鈣化小結。

1.4.2 轉基因hADSCs向成脂細胞分化：細胞在成脂誘導分化體系即地塞米松（10-6mol/L）、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤IBMX（0.5mmol/L）、胰島素（10μg/ml），吲哚美辛（100μmol/l）中誘導14天，油紅O染色法檢測脂滴。

1.4 統計學處理：實驗所得數據采用SPSS13.0統計分析軟件進行分析，應用t檢驗檢測組間差異，并以均數±標準差( x±s)表示，P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1體外分離、培養hADSCs的形態觀察與鑒定：原代細胞接種1天后在倒置顯微鏡下可觀察到散在的多角形貼壁細胞，7天后細胞形態逐漸轉化為成纖維細胞樣的長梭形(圖1)，細胞融合后呈放射狀或漩渦狀，生長迅速，倍增時間約24～28 h，P3代至P10代細胞間無明顯形態變化。取第3代細胞行流式細胞儀檢測結果顯示：細胞表面分子CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166呈陽性表達，CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR呈陰性表達(圖2)。CD49d和CD106是脂肪間充質干細胞和骨髓間充質干細胞的區分標記[1]，表型鑒定可初步確定為hADSCs。

2.2Ad5F35-EGFP及LV-EGFP對體外培養hADSCs的轉導效率：Ad5F35-EGFP（MOI=25、50、100、200、400）感染hADSCs，1天后倒置顯微鏡即可觀察到EGFP陽性細胞，隨著病毒量增加，表達EGFP的細胞陽性率增加。感染后3天各組EGFP表達達到高峰，并可維持至感染后7天，此后至14天左右，陽性細胞數量開始減少，熒光強度逐漸降低至至消失。Ad5F35-EGFP（ MOI=800）對hADSCs有細胞毒性(部分細胞皺縮死亡)，后續的實驗無法繼續進行。LV-EGFP（MOI=25、50、100、200、400、800）感染hADSCs后，1天觀察到少量細胞表達EGFP，隨著時間延長，EGFP陽性細胞逐漸增多，直至7天表達EGFP細胞數量及亮度不再有明顯變化，此時MOI=25轉導效率為（15.5±1.4）%，隨著MOI增加轉導效率逐漸增加，最高至MOI=400時為（92.0±1.7）%，MOI=800時轉導效率無顯著提高。LV-EGFP感染后21天仍可見大量EGFP陽性細胞。感染后7天相同MOI值條件下，Ad5F35-EGFP對細胞的感染效率均高于LV-EGFP(P<0.05)。流式細胞儀定量檢測感染后hADSCs表達EGFP陽性率結果見表1。

2.3MTT法檢測結果：Ad5F35-EGFP及LV-EGFP在MOI值=25、50、100、200、400時感染hADSC所檢測A值，與對照組（MOI=0）相比無顯著差異(P>0.05)。在高MOI（800）條件下，Ad5F35-EGFP對hADSC增殖有抑制作用，LV-EGFP與對照組A值相比無明顯差異，見圖2。

2.4轉基因hADSCs體外誘導分化能力檢測

2.4.1 轉基因hADSCs成骨誘導分化：轉染EGFP基因的hADSCs經過成骨誘導培養體系培養14天后，行Von Kossa染色發現有明顯的鈣化基質沉積，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到成骨分化后的細胞仍然表達EGFP (圖3A，3B)。

2.4.2 轉基因hADSCs成脂誘導分化： 轉染EGFP 基因的hADSCs經過成脂誘導培養體系培養14天后，光鏡下可見80%以上的細胞胞漿內充滿脂肪小泡，油紅O染色呈陽性反應，對照體系不表達或只有微量表達。在倒置熒光顯微鏡下觀察到分化后的細胞仍然表達EGFP (圖4A、4B)。

3討論

hADSCs具有組織來源豐富，獲取效率高，可誘導分化為成骨、軟骨、脂肪、肌及神經前體細胞，分泌肝細胞生長因子、轉化生長因子β等細胞因子，以旁分泌方式促進血管新生并保護缺氧細胞等特點[5-6]，在基因治療及組織工程再生醫學領域具有重要的應用價值。本研究通過流式細胞儀檢測細胞表面分子結果顯示：CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR陰性，CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166陽性。其中CD105和CD166為干細胞標志分子[7]；hADSCs表達CD49d，不表達CD106，與文獻報道一致[4]；HLA-DR陰性表明其具有同種異體移植的可能性[8]。通過對細胞表面標記檢測，實驗所獲得的細胞可初步確定為hADSCs[9]。

選擇合適的載體將目的基因有效整合到hADSCs并保留其干細胞多向分化的特性，是研究hADSCs體內、外分化潛能及跨胚層分化潛能的關鍵步驟。腺病毒載體靶細胞范圍廣，能感染復制分裂細胞及非分裂細胞，感染效率及外源基因表達水平高，不整合入宿主細胞DNA，外源基因的表達隨著時間的延長而減弱[10]，被廣泛用于基因治療、基因疫苗等實驗研究，其中Ad5F35型腺病毒載體對Ad5型腺病毒載體感染較差的細胞，特別是造血系統細胞、干細胞及部分腫瘤細胞的轉導效率較高[11-12]。慢病毒載體是一類逆轉錄載體，其基因組能整合入宿主細胞基因組，持久穩定表達外源基因。“第三代”慢病毒載體，其基因組的3'LTR的增強子功能缺失，從而形成自滅活（Self-inactivation,SIN），具有良好的安全性；病毒包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒的VSV-G蛋白，使病毒能感染分裂和非分裂細胞。與MuLV等逆轉錄病毒載體有致瘤活性相比，慢病毒載體未發現有致腫瘤活性[13]。

本實驗使用了攜帶EGFP報告基因的Ad5F35與第三代LV載體分別對hADSCs進行感染，檢測轉導效率和外源基因表達差異。實驗結果表明，Ad5F35-EGFP、LV-EGFP均可以有效感染體外培養的hADSCs并表達外源基因EGFP。Ad5F35-EGFP感染hADSCs后1周內可見EGFP高表達，而LV-EGFP感染hADSCs后21天，仍能觀察到EGFP高表達。在相同MOI值條件下，Ad5F35-EGFP對hADSCs的轉導效率均高于LV-EGFP。轉導效率與病毒的用量間存在量效關系。在實驗中我們還觀察到，Ad5F35-EGFP在高MOI值（800）時對hADSCs有細胞毒性。因此，盡管Ad5F35對hADSCs的轉導效率略高于LV，但LV在外源基因表達時長及安全性方面更具優勢，LV作為hADSCs的外源基因修飾載體，具有良好的應用前景。

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[收稿日期]2009-01-28[修回日期]2009-02-12

編輯/張惠娟