力學因素在體外構建組織工程化軟骨中的應用

田　甜　章慶國

田甜 綜述，章慶國 審校

[摘要]力學因素是軟骨組織工程中的重要影響因素之一。近年來的研究表明，力學作用可以刺激細胞外基質的分泌，改變三維支架上培養的軟骨細胞的新陳代謝，從而促進軟骨組織的生長與重建。本文就力學因素對軟骨細胞增殖分泌的促進、力學刺激的傳導機制及生物反應器在軟骨組織工程中的應用等方面做一綜述。

[關鍵詞]力學載荷；軟骨細胞；力學信號；生物反應器；軟骨組織工程

[中圖分類號]Q813 R318.01 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0405-03

Application of mechanical loading in vitro with constructing tissue-engineered cartilage

TIAN Tian1,ZHANG Qing-guo2

(1.Department of Plastic Surgery, Affiliated Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009,Jiangsu,China; 2.Auricular Reconstructive Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100144, China)

Abstract: Mechanical factor is one of the most important factors in cartilage tissue engineering. Recently,this research study have been revealed that mechanical loading can stimulate the release of extracellular matrix, changes the neo-metabolic activity of cultured chondrocytes in 3D scaffolds, and subsequently accelerate the growth and remodeling of cartilage tissue. The aim of review is to discuss the promotion of proliferation and secretion of chondrocytes by mechanical factor, mechanisms by which chondrocytes respond to mechanical signals, and the applications of bioreactor in cartilage tissue engineering.

Key words: mechanical loading; chondrocyte; mechanical signal; bioreactor; cartilage tissue engineering

多種原因造成的關節軟骨病變比較常見，軟骨損傷后缺乏自愈能力，尋找軟骨缺損修復的方法一直是臨床的難題。近年來，隨著組織工程學技術的發展，開展體外構建組織工程化軟骨的研究越來越被人們重視。適當的力學刺激因素可以在一定程度上克服傳統軟骨細胞培養條件的不足，滿足細胞在可吸收聚合物中的營養需要，減少處于中心部位的軟骨細胞由于營養不良或代謝不暢而導致的生長遲滯甚至死亡。因此，對軟骨細胞進行三維立體培養時，研究力學刺激對細胞的影響、力學信號的傳導機制以及應用生物反應器對體外培養的細胞大規模擴增都將對軟骨組織工程的發展有著非常重要的意義。

1軟骨組織的生物力學性狀

軟骨由軟骨細胞和軟骨基質構成，軟骨細胞包埋于軟骨陷窩內，軟骨基質由軟骨細胞產生和分泌。軟骨基質主要由膠原和蛋白多糖組成。膠原纖維在軟骨的不同層面排列形成不同結構，具有很強的拉伸性能；蛋白多糖凝膠分散在膠原纖維網之間，本身不具有抗壓作用，但由于蛋白多糖有很強的吸水膨脹性，加上蛋白多糖上經常有固定負電荷互相排斥，使它有充分擴展傾向，而這個傾向卻被周圍的膠原纖維網約束了，最終兩者達到壓力平衡[1]，使軟骨內部在未受外力時就存在一個膨脹壓（滲透壓）。當外力大于膨脹壓時，引起液體外流，蛋白多糖濃度增加，滲透壓增大以對抗外壓力，同時將壓力傳遞給膠原纖維，使壓應力轉化為張應力。因此，外界因素如異常應力導致蛋白多糖、膠原的減少、破壞或微細結構的改變等，都會引起關節軟骨力學性能的變化。

2力學刺激的應用

2.1 壓力：壓力是正常人體關節軟骨最主要的受力，可以將其看成是由一系列隨時間變化的動態成分和隨時間緩慢發展的靜態成分組成[2]，因而體外研究實驗多采用的壓力方式有兩種：一種是持續靜壓力，另一種為動態壓力。

靜壓力多為早期研究所關注的加載方式，它的施加使組織保持持續恒定的壓縮狀態，但普遍發現基質的合成將受到抑制。近年的研究對于靜壓力的作用效果有更深一步理解，Quinn 等[3]認為靜壓力使培養基內可溶物質運輸受限，而導致軟骨細胞代謝水平下降，Ragan 等[4]發現40h持續靜壓力只是促使新合成的蛋白多糖分子流失到培養基中，并不伴隨蛋白多糖分子的大小、成分的改變，認為靜壓力不引起細胞代謝途徑的變化。

研究發現，在循環動態壓力作用下，軟骨組織內四種物理特性發生變化：靜水壓、毛細液流及其引起的離子濃度與電荷變化、流能和組織與細胞變形。Huang 等[5]分組對骨髓間充質干細胞施加周期性壓力(強度為壓縮10%、頻率為1 Hz，4 h/d)，處理3、7、14天后, 發現TGF-β1 干預組、壓應力干預組、TGF-β1與壓應力復合干預組的TGF-β1 及軟骨分化標志物的表達, 均較靜止對照組增強，提示壓應力可能促進骨髓間充質干細胞的軟骨性分化，并推斷其通過增強TGF-β1基因表達來調節。一些生長因子也與力學刺激具有某種聯系，如生理范圍內的正弦動態壓力刺激可使胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對關節軟骨蛋白及蛋白多糖合成的促進作用的時間提前，提示力學作用不但可以單獨刺激關節軟骨細胞，還可促進IGF這種可溶性細胞生長因子與相對分散的單個細胞的結合[6]。這也提示聯合應用力學因素和生物活性因子優于應用單一方法，可以更有效地進行體外軟骨組織構建和體內缺損的修復。

2.2 流體靜壓力：流體靜壓力，也有稱其為生理液態壓力，是生理活動時對軟骨細胞影響最大的力[7]。實驗表明選用的間歇性流體靜壓力負荷低于或近似于生理水平(1～10MPa)，將不會引起細胞形變[8]，并能提高軟骨細胞蛋白多糖和Ⅱ膠原的mRNA 的表達水平[9]，對基質的合成、積累有重要作用；而超過生理范圍的持續高流體靜壓力則會改變細胞骨架結構、破壞高爾基體，導致正常的軟骨細胞向關節炎樣細胞變化[10]。

2.3 剪切力：流體剪切力是機體內微環境重要組成部分。目前，流體剪切應力模型有錐板流動室、平行平板流動室、板板流動室、圓柱管流動室和徑向流動室。李洪鵬等[11]利用平行平板流動室對人骨髓間充質干細胞加載0.5Pa 的流體剪切力30min后，發現細胞增殖能力提高，細胞活性增強，S期細胞百分比較對照組增高約180%。Malaviya等[12]將3.5Pa的流體剪切力作用到單層培養的牛原代關節軟骨細胞上，96h后發現流體剪切力可明顯促進軟骨細胞的增殖，施加剪切力組培養液中的TGF-β1是靜止組的3.5倍，培養液起到了有絲分裂原的作用；當用抗TGF-β1抗體或抗TGF-β1II型受體抗體時，這種作用被阻斷，但由于阻斷作用是部分的，可以推測流體剪切力促進軟骨細胞的增殖是部分TGF-β1及其受體介導的。Waldman等[13]選用小幅度的剪切力（1%～3%應變），先將軟骨細胞種植在生物陶瓷支架中，讓其自由生長4 周后，再施加間歇性剪切力作用4周，結果發現8 周后的樣本對比未加力組，無論從厚度、脫水重量、壓縮模量、平衡模量還是蛋白多糖、膠原量都顯著增加，這可能與剪切力作用改變了細胞外基質超微結構有關，有待進一步研究。

2.4 離心力：離心力的施加主要是利用復合物在離心機內高速旋轉，從而對復合物產生離心力，該辦法不要求特殊設備，較為簡單。將高密度軟骨細胞接種在離心管內，離心力可能發揮了類似生物體內應力的作用，可以使軟骨細胞按固定方向進行空間排列，在支架材料中形成一定的初期分布，有利于營養物質的交換和細胞的增殖代謝。孔清泉等[14]將軟骨細胞種植在脫細胞軟骨基質材料上，并移入離心管中培養，每天取出離心管置于離心機上離心3次，每次離心時間20min，相對離心力約為200g，復合物培養至8 周后與靜態培養組比較發現，離心力的作用主要是能刺激軟骨細胞分泌GAG和Ⅱ型膠原增加，并使該類軟骨組織具一定層次排列結構，而靜態培養的類軟骨組織排列較為紊亂。劉天一等[15]研究離心力和搖床力對三維支架軟骨誘導劑培養的豬骨髓間充質干細胞向軟骨分化的影響，發現第4 周和8 周時，兩組實驗組的細胞材料復合物形狀保持良好，細胞生長情況、軟骨陷窩形成、蛋白多糖沉積及Ⅱ型膠原合成均明顯優于對照靜止組，從而表明種子細胞體外構建組織工程化軟骨中, 施加力學刺激也可以促進軟骨組織成熟。

2.5 張力：在生物體運動過程中, 細胞組織常常受到動態的牽拉應力作用, 體內牽拉力是通過細胞外基質傳遞到細胞的，因此張應力學模型通常是以彈性膜為基底材料，利用模板、液體或氣體對基底膜施加可控的位移或壓力作用, 引起培養膜發生彈性變形, 從而使粘附于膜上的細胞受到相應的張應變作用。Wright等[16]對體外培養的人長骨關節軟骨細胞施以牽張力后發現，細胞cAMP及蛋白多糖的合成增加。低頻率、低強度的牽張力可促進軟骨細胞合成分泌蛋白多糖，而高頻率、高強度的牽張力則抑制蛋白多糖的合成和分泌[17]。所以適當的張力可促進單層培養軟骨細胞的增生和分泌，這與體內研究的結果一致。

3力學載荷可能的信號傳導機制

力學刺激體外細胞所引起一系列的變化，是通過一定的途徑, 將細胞外力學信號傳導至細胞內，從而啟動或調節相關的基因蛋白表達分布。國內外大量研究表明，機械載荷刺激細胞組織后，其基本的機械力學信號轉導機制與調節過程具有相同信號途徑，主要為3 條：通過細胞外基質信號-跨膜整合素-細胞骨架構像改變對信號的傳遞，激活細胞膜力敏感離子通道介導細胞內鈣離子水平升高，觸動G蛋白偶聯酪氨酸激酶磷酸化與促分裂原活化蛋白激酶調節的級聯反應, 各信號分子之間存在網絡狀調控, 最后導致轉錄因子的激活。戚孟春等[18]用過高的牽拉應力(4 000με,0.5Hz)系統干預骨髓間充質干細胞后，激光共聚焦顯微鏡觀察到細胞骨架F-actin解聚和重排, 并誘發部分細胞發生凋亡，表明細胞骨架是骨髓間充質干細胞傳導力學信號通路中重要的一環。整合素對于許多類型的細胞粘著于細胞外基質蛋白具有重要作用，是介導力學的重要物質，因為它們能夠與肌動蛋白結合的蛋白質相互作用，通過細胞骨架來與細胞外基質產生聯系。Holmvall等[19]在軟骨細胞中及軟骨肉瘤細胞中均可分離到α1β1和α2β1整合素，能夠表現與軟骨特異性基質成分II型膠原的高親和性；在力學刺激下，基質成分II型膠原及整合素mRNA均明顯升高，而β1整合素亞單位并未改變，α5或α2整合素有所升高，α2β1整合素與II型膠原結合位點很可能介導了力學刺激。

4生物反應器的應用

目前體外軟骨構建技術主要存在組織“空心”、力學強度差以及難以精確塑形等問題。生物反應器的出現及其在軟骨組織工程中的應用為解決這些問題帶來了希望[20]，主要是因為它能模擬體內微環境，為細胞生長傳輸物質，并可施加各種力學刺激，彌補體外培養條件的不足。因此，生物反應器已逐漸成為軟骨組織工程的一個重要研究領域。

4.1 機械攪拌式生物反應器：該生物反應器的支架-細胞復合物懸在反應器的瓶塞上，支架周圍加入培養液，位于培養瓶底部的磁棒不斷攪拌，每隔數日更換培養液以保持營養。這種生物反應器的剪力梯度與營養酸堿度變化曲線及不均勻的物體交換率可影響細胞生長。然而，這樣的培養體系能使CO2和O2的濃度達到一個類似正常的平衡狀態，避免靜態培養中O2的降低和CO2的聚集[21]。

4.2 灌注式生物反應器：該生物反應器用繼發性液流替代機械性攪拌，通過蠕動移液泵使培養液循環流動。其中的細胞處于一個動態層流場且時刻保持恒定營養供應的環境，同時還避免了常規一次性全部換液帶來的培養環境的驟變[22]。與振蕩式生物反應器相比，它所培養的細胞密度可提高20倍。目前，這一裝置多用于三維材料-細胞復合體的培養。

4.3 間歇性生理液壓生物反應器：該生物反應器是先將軟骨細胞或軟骨塊置于培養皿中，其中加滿完全培養液，將培養皿上蓋雙層壓力膜，排出培養皿內空氣，使壓力膜與培養皿貼緊至不留氣泡。將該培養皿置于圓柱形壓力室中，壓力和頻率由計算機控制下的壓力閥來調控。Carver等[23]發現間歇性生理液態壓力可明顯促進聚羥基乙酸網上培養的馬軟骨細胞細胞外基質的合成與分泌，其蛋白多糖的含量至少是無壓力培養下的兩倍。

4.4 旋轉式微重力生物反應器：該生物反應器由兩個同軸的容器構成，內瓶靜止，允許氣體通過瓶壁與外瓶交換；外瓶瓶壁封閉，兩瓶中間為培養液。通過調節外瓶轉速，使離心力和重力平衡，達到模擬體內細胞所處的微重力狀態。該系統使細胞在支架材料內分布較均勻、分化狀態較好且細胞密度較大[24]。在軟骨細胞體外擴增的初期，由于軟骨細胞和支架材料尚未復合緊密，力學作用會使復合不牢的軟骨細胞脫落而無法達到軟骨細胞-支架材料共同培養，體外擴增的目的。而該裝置破壞性應力相對較小或無明顯破壞性應力，可以克服上述問題，并產生大的軟骨，且組織結構及成分都接近正常軟骨，可以用于修復關節軟骨的缺損。

5小結

模擬正常體內的力學環境對于體外構建組織工程化軟骨起到非常重要的作用。利用動態壓力、流體靜壓力、剪切力、離心力、張力都能提供不錯的力學刺激，尤其是生物反應器的設計與應用更加優化了培養環境，提高了工程化軟骨的質量。雖然力學因素的作用機制還不十分明確，構建的組織工程化軟骨的生物力學性能仍低于正常體內軟骨的力學性質, 但隨著研究的深入和科學技術的發展, 用組織工程技術來修復軟骨缺損及病變的時代已不再遙遠。

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[收稿日期]2008-12-27[修回日期]2009-02-11

編輯/張惠娟