軟骨組織工程支架材料研究進展

李德?！≌聭c國

李德保 綜述，章慶國 審校

[摘要]各種原因引起的關節軟骨損傷在臨床工作中非常常見，但臨床治療手段有限，組織工程的發展為關節軟骨損傷的修復提供了新的途徑。在軟骨組織工程中支架材料起著重要作用，選擇合適的載體是一個首先要解決的問題。本文對目前軟骨組織工程支架材料的現狀做一綜述，指出了當前軟骨組織工程所面臨的問題, 并針對此問題對未來軟骨組織工程材料的研究作出了展望。

[關鍵詞]軟骨；支架材料；組織工程

[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0408-03

Advancement of research of scaffold in cartilage tissue engineering

LI De-bao1，ZHANG Qing-guo2

(1.Department of Plastic Surgery，Affiliated Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009 Jiangsu,China; 2.Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144,China）

Abstract: Articular cartilage defect is caused by various factors and is frequently seen in clinical field but it is limited in treatment. The evolvement of tissue engineering, a new method promises to render the repair of articular cartilage injury. Scaffold material plays important role in cartilage tissue engineering, so selection of an appropriate carrier is to be done firstly. The aim of this review is to discuss the current status of scaffolds, and problems in cartilage tissue engineering. In future, ideas are promising to solve the problems in the field of cartilage tissue engineering.

Key words: cartilage; tissue engineering; scaffold

由于創傷、骨關節炎以及骨軟骨病引起的軟骨畸形或缺損在臨床上非常常見。軟骨組織缺乏血運，軟骨細胞有絲分裂活性低，自我修復能力有限，嚴重影響了軟骨缺損的愈合，目前的治療方法主要有微骨折術、軟骨下骨鉆孔術、軟骨下磨削術、自體軟骨移植和自體軟骨細胞移植術，但是這些治療方法都存在許多不足之處[1-2]。組織工程技術的發展為軟骨再生修復提供了新的選擇。組織工程[3]就是應用生命科學和工程學的原理和方法,研究開發能夠修復、維持或改善損傷組織功能的生物替代物的一門新興學科。組織工程主要包括三方面[4]：種子細胞、支架材料和細胞因子，其中支架材料是軟骨組織工程的研究熱點之一，本文就軟骨支架材料研究進展進行綜述。

1軟骨組織工程支架材料特點

支架材料為軟骨組織構建提供了一個三維的環境，理想的生物支架材料應具有以下特點[5]：①有良好的組織相容性，無毒，無致畸性；②有三維立體結構：材料必須是高度多孔的，一般要求孔隙率達90%以上，為細胞黏附生長、細胞營養成分的滲入以及細胞代謝產物的排出提供有利條件；③生物可降解性和降解率：材料應是可吸收的，在組織形成過程中逐漸分解，從而不影響新形成組織的結構和功能，降解速度與組織再生的速度相匹配；④良好的細胞界面：材料應具有良好的表面活性，有利于細胞貼附，并為細胞在其表面生長、增殖和分泌基質提供良好的微環境；⑤具有可塑性和一定的機械強度：材料可以被加工成所需要的形狀和大小，并有一定的機械強度，在體內一定時間內仍可保持自身形狀，從而使新形成的組織具有一定的外形。

2軟骨組織工程用材料分類

目前軟骨組織工程支架材料種類繁多[6],主要可分為三類：①天然高分子支架材料，如藻酸鹽、纖維素、殼聚糖、膠原、硫酸軟骨素、明膠、纖維蛋白以及透明質酸等；②人工合成材料，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯、多肽、聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸與聚羥基乙酸的共聚體(PLGA)等；③復合材料，如明膠/硫酸軟骨素/透明質酸鈉、聚氧化乙烯/甲殼素/殼聚糖、殼聚糖/明膠、羥基磷灰石/膠原/透明質酸等。

2.1 天然高分子支架材料：殼聚糖為甲殼類動物、昆蟲以及其他無脊椎海洋動物外殼,真菌的細胞壁中的甲殼素(β-1、4聚-2-乙酰胺基-D-葡糖)脫乙醇化而制得,結構與葡萄糖胺聚糖（GAG）相似，因此可以模仿體內的環境，保進軟骨細胞的生長，具有良好的生物相容性和抗菌性。殼聚糖水凝膠作為軟骨支架，可誘導軟骨細胞外基質生成[7]。Nettles[8]等用殼聚糖的溶液經凍干法制得立體支架，然后將豬軟骨細胞植入這種殼聚糖支架上，體外培養6周，免疫組化顯示有葡萄糖胺聚糖及Ⅱ型膠原生成。膠原是構成各種細胞外間質的聚合物，其中Ⅱ型膠原是軟骨組織的主要成分，其突出優點是無抗原性，生物相容性好，動物體內試驗表明將膠原支架填充于軟骨缺損處可形成類似透明軟骨，缺點是降解太快，新生組織往往達不到很好的塑形[9]。藻酸鈣是一種理想的水凝膠支架材料，藻酸鈣凝膠對細胞的培養是三維培養，內部孔隙多，適合細胞黏附和營養交換。將懸浮有兔自體軟骨細胞的藻酸鈉和氯化鈣相混合，修復自體軟骨缺損，4～6個月后發現缺損區有正常的軟骨組織[10]。透明質酸[11]是構成關節軟骨的主要成分之一，作為支架材料，能為種子細胞的生長提供類似胚胎軟骨發育的微環境。纖維蛋白凝膠是利用血液凝固的機理使纖維蛋白單體在凝血酶作用下聚合成立體網狀凝膠，可為細胞生存提供良好的三維空間，也能促進Ⅱ型膠原的表達，缺點是降解速度過快[12]。纖維素是自然界中廣泛存在的線性糖的聚合物，主要通過酶降解,具有良好的生物相容性。細菌纖維素是類似于天然纖維素的高分子化合物，Bodin等認為細菌纖維素，不但價格低廉，還具有高強度，可塑性好,可用于關節半月板損傷的治療[13]。

2.2 人工合成材料：人工合成材料是一類有機高分子聚合物，具有良好的物理機械性能，通過調節分子量及其分布以適應不同需要，作為軟骨組織工程支架材料能較好的誘導軟骨細胞黏附、增殖和分化。聚羥基乙酸(PGA)是一種高度結晶、具有親水性的線性聚脂體，在體內可以通過正常的代謝途徑完全排出體外。聚乳酸(PLA)與聚羥基乙酸（PGA）相比，水溶性較差，降解半衰期較長，可以提供更長時間的支架作用。PLGA是聚乳酸和聚羥基乙酸按一定比例形成的共聚物，可以結合二者各自的特性，既能提供足夠時間的支架作用，又有利于細胞黏附生長。Shin等學者將PLA和PGA按1:1和3:1兩種不同比例混合，結果顯示按1:1比例混合的材料更容易降解[14]。曹誼林等[15]將牛肋軟骨細胞接種于人耳形狀的PGA支架后植于裸鼠皮下, 形成了具有人耳形狀的軟骨組織，實驗表明軟骨細胞可較快地附著于PGA材料表面，PGA大約在植入3周后開始降解, 其降解速度與軟骨組織的形成速度基本匹配, 新生的軟骨組織保持了最初聚合物支架的形狀。

2.3 復合材料：隨著組織工程的發展,人們認識到單一成分構成的三維支架難以滿足器官組織工程基本要求。將兩種或兩種以上的具有互補特性的生物材料，按一定比例和方式組合在一起，可以設計構造出能夠滿足不同器官組織工程的復合支架材料。將Ⅱ型膠原加入PLGA中可以增加軟骨細胞增殖和膠原沉積,同時會減輕炎癥反應[16]。Yoo HS等[11]將透明質酸（HA）加入PLGA中可以增加軟骨細胞黏附以及GAG和膠原的合成。Hua Wu等[17]研究顯示合適比例的多孔聚丙酯/殼聚糖復合支架要比單純多孔聚丙酯支架具有更好的生物學特性,不僅能增強細胞黏附、增殖，還能促進Ⅱ型膠原的產生。Sarasam A等[18]報道殼聚糖/聚己內酯（PCL）復合支架具有較好的機械力學特性。Kuo YC等[19]研究顯示聚氧化乙烯/甲殼素/殼聚糖復合支架比單一支架具有更強的生物活性和力學彈性。

3材料的表面修飾與改性

材料的性能因素主要是指材料表面的親疏水性、電荷及化學結構，無論是天然材料，還是合成材料，在細胞親和性和細胞黏附性上都存在種種不足。利用化學改性和等離子噴涂等[20]方法在材料上引入特殊的蛋白質、肽以及其他的生物分子，可以模擬出細胞外基質環境，形成一個多功能的細胞黏附表面，會使材料的細胞親和力和細胞黏附力增強[21]。Dee等[22]在支架上整和上一段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸多肽鏈，可以促進細胞的黏附與生長，多聚賴氨酸（PLL）包埋細胞支架也取得同樣效果。膠原仿生肽（CMP）是一種由特殊氨基酸序列組成的物質,與Ⅰ型膠原分泌有關，Lee及其同事將CMP交聯到聚乙二醇(PEG)水凝膠上，免疫組化顯示細胞外基質（ECM）分泌明顯增加[23]。

4多孔聚合物支架的制備方法

多孔聚合物支架的孔徑大小根據制作工藝的不同而不同，一般為10～200μm。支架的孔與孔之間可相互連接，細胞可深入支架內部生長,而孔隙率及孔尺寸取決于支架制備方法。目前多孔聚合物材料的制備方法主要有纖維粘接法、粒子致孔法、氣體發泡法和相分離法等[24-27]。纖維粘接法是將不相連的PGA纖維編織成三維連通的纖維網，Mikos等[24]將PGA纖維浸到PLLA的氯仿溶液中待溶液揮發后，PGA纖維網嵌入到PLLA中形成復合物，隨后加熱，PLLA因熔點低而先充滿PGA纖維網中，最后經過熱處理，選用只能溶解PLLA的溶劑將其溶解，就可得到多孔支架，這種方法得到的多孔支架強度較低，有機溶劑會有殘留，易導致種植細胞損傷。粒子致孔法是將材料和致孔劑粒子充分混合，然后利用二者不同的溶解性或揮發性，將致孔劑粒子除去而得到多孔材料，其優點是能得到預先設計的孔徑及孔隙率。氣體發泡法采用氣體作為致孔劑，在制孔過程中不使用有機溶劑，形成多孔泡沫結構，孔徑約100μm，孔隙率達93%，優點是不需濾除過程，但形成氣孔在多數是非連通的。Harris等[25]將氣體發泡技術和致孔劑瀝濾技術相結合制備了PLGA多孔支架。相分離法包括乳化/冷凍干燥和熱相分離法。乳化/冷凍干燥[26]是利用深度冷凍使溶劑真空升華的原理制備多孔材料的一種技術，支架的孔形態、機械性能、生物活性可由溶液中的不同聚合物濃度，淬火溫度等控制。熱液相分離主要是利用熱力動力學原理，在聚合物溶液中形成了富含聚合物和聚合物貧乏的兩相，去除聚合物貧乏相可形成高滲透多孔網狀聚合物?？刂葡喾蛛x的條件,可以控制所得聚合物材料的密度、孔徑大小以及孔的形態等，但實現難度較大。Blaker等[27]利用熱致相分離得到具有敞開、互連、規則孔結構的骨支架材料。

目前興起的電子編織技術和生物打印技術為構建精細三維支架提供了可能[28]。就目前的情況而言，最好是選擇適當的方法將幾種材料組合成復合材料，取長補短，模擬天然軟骨基質組成成分，負載各種有利軟骨細胞生長、增殖和分泌基質的細胞因子，結合計算機輔助設計和三維打印快速成形技術，將生物可降解材料預制加工成精確形狀(如耳廓、氣管、鼻假體等)，通過降解速率較慢的內支撐支架，維持材料支架的精確外形，研發具有一定機械強度、適當孔徑和精確外觀形狀的可降解生物支架材料。

5問題與展望

隨著生物技術、材料學以及計算機的迅猛發展，關于軟骨組織工程支架材料的研究也取得很大進展。目前實驗中的軟骨支架材料,無論是天然的,還是人工合成的，都存在一定的缺陷，例如體內吸收過快或過慢，生物相容性問題，支架表面結構也影響細胞的黏附和生長。軟骨缺損多數形狀不規則，雖然注射式材料可以用于修復這類不規則缺損，但其機械性能方面較差，難以滿足臨床要求。此外，支架的降解速度對骨軟骨缺損修復進程也是很關鍵的，溶解慢的支架可以在其表面維持較厚的軟骨，起到很好的塑形作用，但是會影響營養物質的擴散，在這些軟骨表面會出現裂縫以及“空心”現象等[29]。迄今為止，尚未找到一種完全理想的軟骨支架，因此，一方面需要進一步努力探尋具有良好的生物相容性、生物可降解性、無免疫原性、良好的可塑性的軟骨支架材料；另一方面可對現有的軟骨支架材料進行表面修飾改性，促進其吸附軟骨細胞，分泌蛋白多糖和膠原基質等，為軟骨細胞生長提供一個良好的微環境。相信不遠的將來，會有更加理想的軟骨支架材料研制成功，為組織工程軟骨的早日臨床應用打下重要的基礎。

[參考文獻]

[1]Katsuko S,Furukawa,Katsuaki Imura,et al.Scaffold-free cartilage by rotational culture for tissue engineering[J].J Biotechnol,2008,133(1):134-145.

[2]Simon TM,Jackson DW.Articular cartilage:injury pathways and treatment options[J].Sports Med Arthrosc,2006,14(3):146-154.

[3]Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science,1993,260(5110):920-926.

[4]Kim IY,Seo SJ,Moon HS,et al. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications[J]. Biotechnology Advances,2008, 26(1):1-21.

[5]Kim BS,Mooney DJ.Development of biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering[J]. Trends Biotechnol,1998,16(5):224-230.

[6]Trzeciak T,Richter M.Biomaterials in articular cartilage lesions repair[J].Chir Narzadow Ruchu Ortop Pol,2008,73(2):107-111.

[7]Montembault A,Tahiri K,Korwin-Zmijowska C, et al. A material decoy of biological media based on chitosan physical hydrogels:application to cartilage tissue engineering[J].Biochimie,2006, 88(5):551-564.

[8]Nettles DL,Elder SH,Gilbert JA.Potential use of chitosan as a cell scaffold material for cartilage tissue engineering[J].Tissue Eng,2002,8(6):1009-1016.

[9]De Franceschi L,Grigolo B,Roseti L,et al. Transplantation of chondrocytes seeded on collagen-based scaffold in cartilage defects in rabbits[J].J Biomed Mater Res A,2005,75(3):612-622.

[10]Fragonas E,Valente M,Pozzi-Mucelli M,et al.Articular cartilage repair in rabbits by using suspensions of allogenic chondrocytes in alginate[J]. Biomaterials,2000,21(8):795-801.

[11]Yoo HS,Lee EA,Yoon JJ,et al.Hyaluronic acid modified biodegradable scaffolds for cartilage tissue engineering[J].Biomaterials,2005,26(14):1925-1933.

[12]Weisel JW.Fibrinogen and fibrin[J]. Adv Protein Chem,2005,70:247-299.

[13]Bodin A,Concaro S,Brittberg M,et al.Bacterial cellulose as a potential meniscus implant[J]. J Tissue Eng Regen Med,2007,1(5):406-408.

[14]Shin HJ,Lee CH,Cho IH,et al, Electrospun PLGA nanofiber scaffolds for articular cartilage reconstruction: mechanical stability, degradation and cellular responses under mechanical stimulation in vitro[J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2006,17(1-2) :103-119.

[15]Cao Y,Vacanti JP,Paige KT,et al.Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear[J]. Plast Reconstr Surg,1997,100(2):297-302.

[16]Hsu SH,Chang SH,Yen HJ,et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as tissue engineering scaffolding materials for cartilage Regeneration[J]. Artif Organs,2006,30 (1): 42-55.

[17]Hua Wu,Ying Wan, Xiaoying Cao, et al. Proliferation of chondrocytes on porous poly(DL-lactide)/chitosan scaffolds[J]. Acta Biomater, 2008,4(1):76-87.

[18]Sarasam A,Madihally SV. Characterization of chitosan-polycaprolactone blends for tissue engineering applications [J]. Biomaterials,2005,26:5500-5508.

[19]Kuo YC,Ku IN.Cartilage regeneration by novel polyethylene oxide/chitin/chitosan scaffolds[J]. Biomacromolecules, 2008,9(10):2662-2669.

[20]Vsita R,Shanmugam IK,Katt DS,et al.Improved biomaterials for tissue engineering applications:surface modification of polymers[J].Curr Top Med Chem,2008,8(4):341-353.

[21]Vacanti JP,Langer R,Upton J,et al.Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration[J]. Adv Drug Deliv Rev,1998,33(1-2):165-182.

[22]Dee KC,Anderson TT,Bizios R.Osteoblast population migration characteristics on substrates modified with immobilized adhesive peptides[J]. Biomaterials,1999,20(3):221 -227.

[23]Lee HJ, Lee JS, Chansakul T, et al. Collagen mimetic peptide-conjugated photopolymerizable PEG hydrogel[J]. Biomaterials,2006,27:5268-5276.

[24]Mikos AG,Bao Y,Ciam LG,et al. Preparation of poly(glycolic acid) bonded fiber structures for cell attachment and transplantation[J].J Biomed Mater Res,1993,27(2):183-189.

[25]Harris LD,Kim BS,Mooney DJ.Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming[J]. J Biomed Mater Res,1998,42(3):396-402.

[26]Whang K,Goldstick TK,Healy KE. A biodegradable polymer scaffold for delivery of osteotropic factors[J]. Biomaterials, 2000, 21:2545 - 2551.

[27]Blaker JJ, Maquet V, Jér me R,et al.Mechanical properties of highly porous PDLLA/Bioglass composite foams as scaffolds for bone tissue engineering[J].Acta Biomater,2005,1(6):643-652.

[28]Hutmacher DW,Sittinger M,Risbud MV.Scaffold-based tissue engineering: rationale for computer-aided design and solid free-form fabrication systems[J].Trends Biotechnol,2004, 22(7):354-362.

[29]Fuchs JR,Pomerantseva I,Ochoa ER,et al.Fetal tissue engineering:in vitro analysis of muscle Constructs[J].J Pediatr Surg,2003,38(9):1348-1353.

[收稿日期]2008-12-25[修回日期]2009-02-10

編輯/張惠娟