花生內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴增及序列分析

楊 森

摘要設(shè)計1對特異引物,以花生栽培種四粒紅及其與野生種光葉花生的種間雜種為材料,對花生ITS1-5.8S-ITS2序列進行高保真PCR擴增,獲得長度約800bp的單一條帶,在對PCR產(chǎn)物進行克隆測序的基礎(chǔ)上構(gòu)建了花生屬進化樹。

關(guān)鍵詞花生;內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列;PCR;進化樹

中圖分類號Q789文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)08-0103-02

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)廣泛應(yīng)用于被子植物系統(tǒng)進化研究,為禾本科、大豆屬、棉屬等植物的系統(tǒng)進化研究提供了寶貴的分子遺傳學依據(jù)。花生rDNA有關(guān)研究報道較少,盡管有分離 rDNA ITS的報道,但未在此基礎(chǔ)上進行花生屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究對花生ITS序列進行分離、測序,并將其與GenBank中登錄的花生ITS序列進行比較和分析,為花生的系統(tǒng)演化及花生的分類鑒定提供分子水平的證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用花生為栽培種四粒紅(Silihong)及四粒紅與野生種光葉花生的雜交后代(Silihong×Arachis glabrata Benth.)高世代材料。花生種子取自山東省花生研究所萊西試驗站。

根據(jù)Bhagwat等報道的ITS序列,使用軟件DNAS-TAR.Lasergene.v7.1設(shè)計1對特異引物:

ITS1&2-1∶5-GTCGATGCCGCACAAACCAGGATT-3

ITS1&2-2∶5-CGGGCACAACGGGGCTCTCA-3

這對引物的擴增區(qū)包含ITS1、5.8S和ITS2完整區(qū)域。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

取3~5粒花生未成熟的葉片置于1.5mL離心管中,加40μL 0.25mol/L NaOH,用1mL槍頭套一PCR管將葉片搗碎,煮沸30s,加160μL含PVP-40的Tris-HCl(pH值7.6),煮沸2min,10 000rpm離心5min,取上清液4℃保存,用時取1μL作模板。取1-1D4-1、1-4D4-1、四粒紅各品種未成熟葉片按上述步驟作簡單處理,依次編號為1、2、3作為PCR模板。

PCR程序為:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃ 1.5min)30個循環(huán),72℃ 10min。先用Takara Taq DNA聚合酶作PCR,確定有預(yù)期分子量大小的條帶后再用高保真Pfu DNA聚合酶擴增,切膠回收DNA,連接轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測序。利用DNASTAR.Lasergene.v7.1進行多序列比對。

用Mega4.0軟件以擬南芥核rDNA序列為外群組(outgroup),采用3種方法(NJ、ME、MP)構(gòu)建進化樹,并進行bootstrap analysis 1 000檢驗[2]。

2結(jié)果與分析

2.1ITS區(qū)序列的PCR擴增

以總DNA為模版,利用所設(shè)計的 2條引物PCR擴增出ITS區(qū)的特異性條帶,分子量在800bp左右(圖1),與GenBank所登錄的ITS序列片段長度相近。用Taq DNA Pol PCR體系和pfu DNA Pol PCR體系所擴增出的ITS區(qū)序列片段電泳遷移率相同。

2.2ITS1-5.8S-ITS2序列測定與多序列比對

四粒紅與野生種光葉雜交后代擴增產(chǎn)物6份穿刺培養(yǎng)物測序得到3條有差異的條帶,分別命名為1-1、1-2、1-4。四粒紅擴增產(chǎn)物測序后得到的序列命名為3-3。

通過比對發(fā)現(xiàn)4條序列在ITS1-5.8S-ITS2區(qū)共有單核苷酸多態(tài)性位點14個,其中6個位于ITS1區(qū),2個位于5.8S rDNA中,6個位于ITS2區(qū),其他植物上的研究認為5.8S rDNA在進化上相當保守,而ITS1和ITS2則變化很大,本試驗結(jié)果與這一結(jié)論一致。

2.3花生屬進化樹構(gòu)建

通過NJ、ME和MP法構(gòu)建花生屬進化樹,其拓撲結(jié)構(gòu)大致相似,但也有所區(qū)別。總體看來,各個區(qū)組的材料分別聚集到一起,與基于傳統(tǒng)形態(tài)學特征的花生屬區(qū)組劃分基本一致。從本研究所構(gòu)建的3棵進化樹來看,圍脈(Ex)區(qū)組、三籽粒(Tris)區(qū)組、大根(C)區(qū)組在花生屬中是比較原始的,花生區(qū)組(A)進化程度較高;Gregory等根據(jù)花生屬種間可交配性提出圍脈(Ex)區(qū)組、直立(Er)區(qū)組和根莖(R)區(qū)組原根莖系較原始,而花生(A)區(qū)組、三籽粒(Tris)區(qū)組、大根(C)區(qū)組、異形花(H)區(qū)組、匍匐(P)區(qū)組以及根莖(R)區(qū)組真根莖系進化程度較高。

研究結(jié)果表明,圍脈(Ex)區(qū)組、三籽粒(Tris)區(qū)組和異形花(H)區(qū)組親緣關(guān)系較近;直立(Er)區(qū)組和三葉(Trie)區(qū)組關(guān)系密切,兩者與匍匐(P)區(qū)組形成一大的分支。

在本研究構(gòu)建進化樹所涉及的花生材料當中,有3個未命名的種,其區(qū)組歸屬尚不明確,但從所構(gòu)建的進化樹上看,A.sp.DAP-2004-1、A.sp.DAP-2004-2應(yīng)屬于花生(A)區(qū)組,A.sp.DAP-2004-3可能屬于直立(Er)區(qū)組或匍匐(P)區(qū)組。

本研究所得4條序列均與花生區(qū)組的序列聚為一類,其中1-1、1-4與四粒紅(3-3)關(guān)系相近,而1-2與其關(guān)系較遠,說明種間雜種既與母本有相似的地方,也與母本有一定的差異,為雜種的真實性提供了分子水平證據(jù)。

3參考文獻

[1] KRAPOVICKAS A.The origin,variability and spread of the groundnut(Arachishypogaea)(English translation)[M].London:P.J.Ucko and I.S.Falk(eds.),1969.

[2] KRAPOVICKAS A,Gregory W C.Taxonomy of the genus Arachis (Leguminosae)[J].Bonplandia,2007(16):1-18.

[3] 汪小全,洪德元.植物分子系統(tǒng)學近五年的研究進展概況[J].植物分類學報,1997,35(5):465-480.

[4] HAMBY R K,ZIMMER E A.Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics[M]∥SOLTIS P S,SOLTIS D E,DOYLE J J,et al.Molecular Sys-tematics of Plants.New York:Chapman &hall;,1992.

[5] PRINE G M.Perennial peanuts for forage[J].Soil Crop Sci. Soc. Fla.Proc.,1973(32):33-35.

[6] 顧紅雅.限制性片段長度多態(tài)性(RFL Ps)在植物系統(tǒng)與進行研究中的應(yīng)用[M]∥陳家寬,楊繼.植物進化生物學.武漢:武漢大學出版社,1994:209-231.

[7] SECOND G,WANG Z Y.Mitochondrial DNA RFL P in genus Oryz a and cultivated rice[J].Genet Resour Crop Evol.,1992(39):125-140.

[8] 陳之端,汪小全,孫海英,等.馬尾樹科的系統(tǒng)位置:來自rbcL 基因核苷酸序列的證據(jù)[J].植物分類學報,1998,36(1):1-7.

[9] OLMSTEAD R G,PALMER J D.Chloroplast DNA systematics:a re-view of methods and data analysis[J].Amer J. Bot.,1994(81):1205-1224.

[10] WOLFE K H,LI W H,SHARP P M.Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochondrial,choroplast,and nuclear DNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987(84):9054-9058.

[11] 趙鴻,彭德良,朱建蘭.rDNA-ITS-PCR 技術(shù)在植物寄生線蟲分子診斷中的應(yīng)用[J].植物檢疫,2004,18(2):1-6.

[12] KOLLIPARA K P,SINGH R J,HYMOWITZ T.Phylogenetic and genomic relationships in the genus Glycine Willd.Based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA[J].Genome,1997(40):57-68.

[13] AINOUCHE M L,BAYER R J.On the origins of the tetraploid Bro-mus species(section B romus,Poaceae):insights from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA[J].Genome,1997(5):730-743.

[14] 張文駒.應(yīng)用rDNA的ITS區(qū)探討多倍體小麥的基因組起源[D].武漢:武漢大學,1998.

[15] KIM K J,JANSEN R K.Comparisons of phylogenetichypotheses among different data sets in dwarf dandelions(Krigia):additional information from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA[J].Plant Syst. Evol.,1994(3-4):157-185.

[16] SANG T,CRAWFORD D J,KIM S C,et al.Radiation of the endemic genus Dendroseris(Asteraceae)on the Juan Fernandez Islands:evidence from sequences of the ITS regions of nuclear ribosomal DNA[J].Amer J. Bot.,1994(81):1494-1501.

[17] WENDEL J F,SCHNABEL A S,SEELANAN T.Bidirectional interlo-cus concerted evolution following allopolyploidspeciation in cotton(Gossypium)[J].Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1995(92):280-284.

[18] 楊琳,郭愛蓮,何鈞,等.玉米秸稈利用中木質(zhì)素降解中的研究[J].西北大學學報(自然科學版),2001,31(4):334-336.

[19] 李春香,楊群.PCR產(chǎn)物直接測序還是克隆測序?———密葉杉屬rDNA ITS序列的測定方法[J].植物學通報,2002,19(6):698-704.

[20] 孫大容.花生育種學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.