植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗的研究進(jìn)展

及曉宇 于麗杰

摘要隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟,植物已成為基因重組生物制品的重要表達(dá)載體。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗是目前新興的研究領(lǐng)域。綜述了亞單位抗原在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的重組疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗存在的問(wèn)題及解決方法等,并展望了其研究趨勢(shì)和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞植物生物反應(yīng)器;口服疫苗;轉(zhuǎn)基因植物

中圖分類(lèi)號(hào)Q946.1;R282.71文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)08-0210-02

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗的研究異常活躍。從1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物至今,植物基因工程的研究取得了飛速的發(fā)展。以轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)藥用蛋白,如抗體、疫苗等也成為國(guó)際上植物基因工程一個(gè)新的發(fā)展趨勢(shì)。迄今為止,在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的抗原基因約有20多種,隨著研究的深入,轉(zhuǎn)基因植物疫苗以其可食性、廉價(jià)性,成為應(yīng)用廣泛而有發(fā)展?jié)摿Φ囊呙纭?/p>

1植物生產(chǎn)口服疫苗的不同表達(dá)系統(tǒng)

利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗的過(guò)程包括目的基因的克隆、高效表達(dá)載體的構(gòu)建、植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化、受體細(xì)胞的組織培養(yǎng)與植株再生、轉(zhuǎn)化植株的栽培、目標(biāo)產(chǎn)品分離純化與純度鑒定等。其載體表達(dá)系統(tǒng)為:穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)與瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。

1.1穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)化是將目的基因整合到轉(zhuǎn)基因植物的核基因組或葉綠體基因組中,能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)基因植株稱(chēng)為穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。

1.1.1核表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaci-ens)介導(dǎo)。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中含一段T-DNA,能與植物核基因組DNA發(fā)生同源重組,在T-DNA兩側(cè)插入外源基因,外源基因就能與T-DNA一起隨機(jī)整合到植物核基因組中。Mason等將乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中并獲得表達(dá),并用薯塊飼養(yǎng)小鼠,在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到保護(hù)性抗原包括黏膜抗體,以抵御細(xì)菌的侵染。另外,在一些農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物中,如大豆、水稻等不易進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,在這類(lèi)植物中,基因槍法被廣泛應(yīng)用,外源基因可能整合到植物核基因組中。與農(nóng)桿菌法相比,基因槍法具有更高的整合率。

1.1.2葉綠體表達(dá)系統(tǒng)。用基因槍法把外源基因打入葉綠體中,外源基因可能在葉綠體中整合。葉綠體轉(zhuǎn)化體系只應(yīng)用于幾種植物,但是葉綠體的基因拷貝數(shù)很多,利于增強(qiáng)目的蛋白的表達(dá)量,具有很大的潛力;葉綠體基因是嚴(yán)格的母系遺傳,可避免植物傳粉過(guò)程中的基因污染,而且不會(huì)出現(xiàn)基因沉默問(wèn)題。

1.2瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)

通過(guò)整合外源基因的重組病毒感染植物,外源基因隨病毒的復(fù)制而得到高水平的表達(dá),這樣的植物就成了生產(chǎn)疫苗的“綠色工廠”。最常用的2種宿主:病毒表達(dá)系統(tǒng)是煙草和煙草花葉病毒(TMV)及豇豆和豇豆花葉病毒(CPMV)。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)病毒復(fù)制拷貝數(shù)多可提高表達(dá)量。然而,病毒表達(dá)系統(tǒng)不穩(wěn)定,外源基因容易丟失。此外,每株植物都要接種病毒,大大增加了工作量。

2植物生產(chǎn)口服疫苗的研究現(xiàn)狀

2.1植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗的優(yōu)勢(shì)

除了轉(zhuǎn)基因植物,能夠生產(chǎn)重組疫苗的系統(tǒng)有細(xì)菌、酵母、動(dòng)物病毒、植物病毒和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。植物表達(dá)系統(tǒng)與上述疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)相比,具有較大的優(yōu)勢(shì)。植物生物反應(yīng)器具有如下優(yōu)點(diǎn):一是植物生產(chǎn)系統(tǒng)具有廉價(jià)性。植物表達(dá)系統(tǒng)最吸引人之處是它能廉價(jià)地生產(chǎn)高價(jià)值、供不應(yīng)求的蛋白。在獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株后,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因口服疫苗工藝簡(jiǎn)單,不需要昂貴的培養(yǎng)基和復(fù)雜的純化過(guò)程,也不需要嚴(yán)格的無(wú)菌生產(chǎn)和冷藏保存,只需增加耕種面積就能擴(kuò)大其產(chǎn)量并易于栽培管理。二是植物細(xì)胞的全能性。植物的組織培養(yǎng)、細(xì)胞或者原生質(zhì)體在適當(dāng)培養(yǎng)條件下均能再生出完整的植物個(gè)體。藥用基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞后可培育出藥用植物品種,并可穩(wěn)定遺傳。三是安全性。動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因疫苗,常用動(dòng)物病毒作為載體導(dǎo)入抗原基因,生產(chǎn)過(guò)程可能被動(dòng)物病毒污染,這些病毒對(duì)人類(lèi)健康具有潛在的危害性。而在植物中,外源蛋白的生產(chǎn)或通過(guò)重組植物病毒載體的侵染,或通過(guò)外源基因穩(wěn)定地整合進(jìn)植物基因組中來(lái)實(shí)現(xiàn),避免了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物帶來(lái)的倫理問(wèn)題。植物病毒不能感染人類(lèi),表達(dá)產(chǎn)物無(wú)毒性和副作用,安全可靠,無(wú)殘存DNA和潛在的致病性、致癌性。四是植物具有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)產(chǎn)物可糖基化、酰胺化、磷酸化,可完成對(duì)亞基的正確裝配等翻譯后加工過(guò)程,使表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動(dòng)物細(xì)胞一致的免疫原性和生物活性。

2.2利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的重組疫苗

從20世紀(jì)90年代初提出口服疫苗的概念,利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人口服疫苗就成為研究熱點(diǎn)。表1為2000~2007年利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組疫苗和藥用蛋白。

3轉(zhuǎn)基因植物疫苗存在的問(wèn)題和解決方法

利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗是近10年的事情,盡管利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗有很多優(yōu)點(diǎn),但就目前的技術(shù)而言,仍然存在一些急需解決的問(wèn)題,主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)。

3.1重組蛋白的表達(dá)問(wèn)題

重組蛋白的表達(dá)量低,表達(dá)效率不穩(wěn)定,在已報(bào)道的研究中,外源基因所表達(dá)的重組抗原蛋白,大約只占植物可溶蛋白的0.01%~0.37%。為使外源抗原基因更好地在植物中高水平表達(dá),可對(duì)目的基因進(jìn)行修飾,如優(yōu)化密碼子、優(yōu)化抗原表位、添加增強(qiáng)子,或前導(dǎo)序列、添加修飾基因或吸附基因使抗原直接靶向免疫系統(tǒng)等;為消除目的基因轉(zhuǎn)化后的沉默現(xiàn)象,在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),盡量降低目的基因與植物基因組的同源性,對(duì)多基因結(jié)構(gòu)采取不同的啟動(dòng)子和polyA序列,或在轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼接上核基質(zhì)結(jié)合序列以避免位置效應(yīng);選組織用強(qiáng)啟動(dòng)子如來(lái)源于花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子,可增強(qiáng)目的蛋白在葉片中的表達(dá)水平;選用組織特異性啟動(dòng)子,如番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子、馬鈴薯塊莖啟動(dòng)子等,可使目的蛋白在植物的特定部位集中表達(dá)。

3.2用于口服時(shí)易被消化及作用機(jī)理問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是在植物體內(nèi)表達(dá)的亞單位疫苗,生物安全性高,不需要注射,在人們享用美食的同時(shí)就得到了免疫,并排除了繁瑣的疫苗純化過(guò)程。但這種亞單位疫苗沒(méi)有減毒活疫苗免疫性強(qiáng),需要加強(qiáng)免疫來(lái)提高免疫應(yīng)答的水平;另外,消化系統(tǒng)會(huì)降解抗原,因此,要求轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有腸穩(wěn)定性和形成莢膜包被的抗原。細(xì)胞壁是阻止抗原被降解的第1道屏障,植物細(xì)胞膜可進(jìn)一步保護(hù)抗原避免胃液、腸液的降解作用,植物細(xì)胞的次生壁可以使內(nèi)含物釋放更慢,直到達(dá)到小腸內(nèi)植物細(xì)胞壁才開(kāi)始破裂逐步釋放抗原,從而實(shí)現(xiàn)免疫功能,但仍需要對(duì)其中的細(xì)節(jié)問(wèn)題進(jìn)行研究。另外,也可采取在抗原基因上附加修飾基因或吸附基因序列,保護(hù)口服疫苗不易被迅速消化,使之長(zhǎng)時(shí)間地停留在消化系統(tǒng)內(nèi)。

3.3口服抗原疫苗免疫耐受方面的問(wèn)題

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,口服疫苗涉及到口服耐性問(wèn)題。口服疫苗也有可能導(dǎo)致人和動(dòng)物產(chǎn)生口服耐性,從而不再對(duì)疫苗抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng),致使疫苗失去作用。必須研究口服疫苗的安全性、有效劑量和服用時(shí)間表,必須確定口服疫苗是起刺激作用還是抑制作用。

3.4植物疫苗的生物安全性問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問(wèn)題一直是近年來(lái)爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。外源基因是否會(huì)漂到環(huán)境中而破壞環(huán)境;抗生素抗性基因是篩選轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因;長(zhǎng)期使用這類(lèi)轉(zhuǎn)基因是否會(huì)對(duì)人體或動(dòng)物造成抗生素醫(yī)療無(wú)效;轉(zhuǎn)基因植物中新基因會(huì)不會(huì)傳遞給人畜腸道的正常微生物,引起菌群和數(shù)量的變化或插入并表達(dá),從而危害人畜健康。這些問(wèn)題目前都無(wú)法解答,仍需要大量學(xué)者研究證實(shí)。

4利用植物生產(chǎn)口服疫苗前景展望

用轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)有醫(yī)療價(jià)值的抗體、疫苗及一些重要藥用蛋白,具有一定的優(yōu)勢(shì)和良好的前景。轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗優(yōu)勢(shì)突出,具有極大的潛力,20多年來(lái),植物疫苗的研究取得了很大的進(jìn)展。目前,美國(guó)DowAgros-cience公司開(kāi)發(fā)用于預(yù)防禽類(lèi)的NEWCASTLE Concent成為第1個(gè)獲得美國(guó)農(nóng)業(yè)部獸用生物制品中心批準(zhǔn)的獸用植物疫苗,極大地促進(jìn)了人用植物疫苗的研究與開(kāi)發(fā)。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的逐漸深入,相信不久的將來(lái),人們將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的有醫(yī)療作用的蛋白,植物疫苗將廣泛地用于人類(lèi)疾病的預(yù)防。

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