植物生物反應器生產口服疫苗的研究進展

及曉宇 于麗杰

摘要隨著基因工程技術的快速發展、植物轉基因技術的日趨成熟,植物已成為基因重組生物制品的重要表達載體。利用轉基因技術構建植物生物反應器生產口服疫苗是目前新興的研究領域。綜述了亞單位抗原在轉基因植物中的表達系統、轉基因植物生產的重組疫苗、轉基因植物疫苗存在的問題及解決方法等,并展望了其研究趨勢和應用前景。

關鍵詞植物生物反應器;口服疫苗;轉基因植物

中圖分類號Q946.1;R282.71文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)08-0210-02

隨著分子生物學技術的發展,植物生物反應器生產口服疫苗的研究異?；钴S。從1983年首次獲得轉基因植物至今,植物基因工程的研究取得了飛速的發展。以轉基因植物作為生物反應器來生產藥用蛋白,如抗體、疫苗等也成為國際上植物基因工程一個新的發展趨勢。迄今為止,在轉基因植物中表達的抗原基因約有20多種,隨著研究的深入,轉基因植物疫苗以其可食性、廉價性,成為應用廣泛而有發展潛力的疫苗。

1植物生產口服疫苗的不同表達系統

利用植物生物反應器生產口服疫苗的過程包括目的基因的克隆、高效表達載體的構建、植物細胞的遺傳轉化、受體細胞的組織培養與植株再生、轉化植株的栽培、目標產品分離純化與純度鑒定等。其載體表達系統為:穩定表達系統與瞬時表達系統。

1.1穩定表達系統

穩定轉化是將目的基因整合到轉基因植物的核基因組或葉綠體基因組中,能夠穩定表達目的蛋白的轉基因植株稱為穩定表達系統。

1.1.1核表達系統。通過根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaci-ens)介導。農桿菌Ti質粒中含一段T-DNA,能與植物核基因組DNA發生同源重組,在T-DNA兩側插入外源基因,外源基因就能與T-DNA一起隨機整合到植物核基因組中。Mason等將乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因轉入馬鈴薯中并獲得表達,并用薯塊飼養小鼠,在小鼠體內檢測到保護性抗原包括黏膜抗體,以抵御細菌的侵染。另外,在一些農業經濟作物中,如大豆、水稻等不易進行農桿菌轉化,在這類植物中,基因槍法被廣泛應用,外源基因可能整合到植物核基因組中。與農桿菌法相比,基因槍法具有更高的整合率。

1.1.2葉綠體表達系統。用基因槍法把外源基因打入葉綠體中,外源基因可能在葉綠體中整合。葉綠體轉化體系只應用于幾種植物,但是葉綠體的基因拷貝數很多,利于增強目的蛋白的表達量,具有很大的潛力;葉綠體基因是嚴格的母系遺傳,可避免植物傳粉過程中的基因污染,而且不會出現基因沉默問題。

1.2瞬時表達系統

通過整合外源基因的重組病毒感染植物,外源基因隨病毒的復制而得到高水平的表達,這樣的植物就成了生產疫苗的“綠色工廠”。最常用的2種宿主:病毒表達系統是煙草和煙草花葉病毒(TMV)及豇豆和豇豆花葉病毒(CPMV)。瞬時表達系統病毒復制拷貝數多可提高表達量。然而,病毒表達系統不穩定,外源基因容易丟失。此外,每株植物都要接種病毒,大大增加了工作量。

2植物生產口服疫苗的研究現狀

2.1植物生物反應器生產口服疫苗的優勢

除了轉基因植物,能夠生產重組疫苗的系統有細菌、酵母、動物病毒、植物病毒和轉基因動物等。植物表達系統與上述疫苗生產系統相比,具有較大的優勢。植物生物反應器具有如下優點:一是植物生產系統具有廉價性。植物表達系統最吸引人之處是它能廉價地生產高價值、供不應求的蛋白。在獲得轉基因陽性植株后,生產轉基因口服疫苗工藝簡單,不需要昂貴的培養基和復雜的純化過程,也不需要嚴格的無菌生產和冷藏保存,只需增加耕種面積就能擴大其產量并易于栽培管理。二是植物細胞的全能性。植物的組織培養、細胞或者原生質體在適當培養條件下均能再生出完整的植物個體。藥用基因轉化到植物細胞后可培育出藥用植物品種,并可穩定遺傳。三是安全性。動物細胞生產轉基因疫苗,常用動物病毒作為載體導入抗原基因,生產過程可能被動物病毒污染,這些病毒對人類健康具有潛在的危害性。而在植物中,外源蛋白的生產或通過重組植物病毒載體的侵染,或通過外源基因穩定地整合進植物基因組中來實現,避免了轉基因動物帶來的倫理問題。植物病毒不能感染人類,表達產物無毒性和副作用,安全可靠,無殘存DNA和潛在的致病性、致癌性。四是植物具有完整的真核細胞表達系統。表達產物可糖基化、酰胺化、磷酸化,可完成對亞基的正確裝配等翻譯后加工過程,使表達產物具有與高等動物細胞一致的免疫原性和生物活性。

2.2利用轉基因植物生產的重組疫苗

從20世紀90年代初提出口服疫苗的概念,利用轉基因植物生產人口服疫苗就成為研究熱點。表1為2000~2007年利用植物生物反應器生產的重組疫苗和藥用蛋白。

3轉基因植物疫苗存在的問題和解決方法

利用轉基因植物生產口服疫苗是近10年的事情,盡管利用轉基因植物生產疫苗有很多優點,但就目前的技術而言,仍然存在一些急需解決的問題,主要表現為以下幾點。

3.1重組蛋白的表達問題

重組蛋白的表達量低,表達效率不穩定,在已報道的研究中,外源基因所表達的重組抗原蛋白,大約只占植物可溶蛋白的0.01%~0.37%。為使外源抗原基因更好地在植物中高水平表達,可對目的基因進行修飾,如優化密碼子、優化抗原表位、添加增強子,或前導序列、添加修飾基因或吸附基因使抗原直接靶向免疫系統等;為消除目的基因轉化后的沉默現象,在構建表達載體時,盡量降低目的基因與植物基因組的同源性,對多基因結構采取不同的啟動子和polyA序列,或在轉基因的側翼接上核基質結合序列以避免位置效應;選組織用強啟動子如來源于花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子,可增強目的蛋白在葉片中的表達水平;選用組織特異性啟動子,如番茄果實特異性啟動子、馬鈴薯塊莖啟動子等,可使目的蛋白在植物的特定部位集中表達。

3.2用于口服時易被消化及作用機理問題

轉基因植物疫苗是在植物體內表達的亞單位疫苗,生物安全性高,不需要注射,在人們享用美食的同時就得到了免疫,并排除了繁瑣的疫苗純化過程。但這種亞單位疫苗沒有減毒活疫苗免疫性強,需要加強免疫來提高免疫應答的水平;另外,消化系統會降解抗原,因此,要求轉基因植物疫苗具有腸穩定性和形成莢膜包被的抗原。細胞壁是阻止抗原被降解的第1道屏障,植物細胞膜可進一步保護抗原避免胃液、腸液的降解作用,植物細胞的次生壁可以使內含物釋放更慢,直到達到小腸內植物細胞壁才開始破裂逐步釋放抗原,從而實現免疫功能,但仍需要對其中的細節問題進行研究。另外,也可采取在抗原基因上附加修飾基因或吸附基因序列,保護口服疫苗不易被迅速消化,使之長時間地停留在消化系統內。

3.3口服抗原疫苗免疫耐受方面的問題

動物實驗表明,口服疫苗涉及到口服耐性問題?？诜呙缫灿锌赡軐е氯撕蛣游锂a生口服耐性,從而不再對疫苗抗原產生免疫反應,致使疫苗失去作用。必須研究口服疫苗的安全性、有效劑量和服用時間表,必須確定口服疫苗是起刺激作用還是抑制作用。

3.4植物疫苗的生物安全性問題

轉基因植物的生物安全性問題一直是近年來爭論的焦點。外源基因是否會漂到環境中而破壞環境;抗生素抗性基因是篩選轉基因植物常用的標記基因;長期使用這類轉基因是否會對人體或動物造成抗生素醫療無效;轉基因植物中新基因會不會傳遞給人畜腸道的正常微生物,引起菌群和數量的變化或插入并表達,從而危害人畜健康。這些問題目前都無法解答,仍需要大量學者研究證實。

4利用植物生產口服疫苗前景展望

用轉基因植物生物反應器生產有醫療價值的抗體、疫苗及一些重要藥用蛋白,具有一定的優勢和良好的前景。轉基因植物口服疫苗優勢突出,具有極大的潛力,20多年來,植物疫苗的研究取得了很大的進展。目前,美國DowAgros-cience公司開發用于預防禽類的NEWCASTLE Concent成為第1個獲得美國農業部獸用生物制品中心批準的獸用植物疫苗,極大地促進了人用植物疫苗的研究與開發。隨著人類基因組計劃的逐漸深入,相信不久的將來,人們將會發現更多的有醫療作用的蛋白,植物疫苗將廣泛地用于人類疾病的預防。

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