植物線粒體中活性氧的產生與抗氧化系統

孫海平 汪曉峰

摘要活細胞中活性氧不僅在信號轉導方面起著關鍵作用,而且還可以對生物大分子起到傷害作用,所以線粒體中的活性氧必須控制在一定的濃度。植物線粒體中存在幾種抗氧化系統,它們可以控制活性氧的產生,修補活性氧對大分子造成的損傷。其中抗氧化系統包括依賴于抗壞血酸分子和谷胱甘肽分子途徑的,依賴硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)分子 和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxudase,GPX)途徑的。綜述了線粒體中控制活性氧的各種氧化還原反應途徑,并特別強調指出,TRX 和GPX系統,以期能給該方面的研究提供幫助。

關鍵字線粒體;活性氧;抗氧化系統

中圖分類號Q945.1文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)08-0239-02

需氧進行光合作用的生物是在大氣中氧存在的情況下出現和進化的,陸生植物也是在大氣中氧存在的情況下出現和進化的,結果陸生植物形成了不僅可以極大運用氧氣的能力,而且也形成了能限制活性氧不良作用的新陳代謝方式。單線態氧(1O2)、超氧負離子(O2-)、過氧化物和過氧化氫的氧代謝均可以產生活性氧。一方面,由于這些氧化物的有害性,植物需要控制它們在細胞中的含量;另一方面,當植物體遭遇病原體入侵時,活性氧可以作為信號分子起作用。同時,這些分子能使蛋白質發生變化,誘導基因轉錄。這種信號系統是細胞與外環境通信的重要組成部分。

在植物細胞中,葉綠體、線粒體和過氧化物體是產生活性氧的部位,由于活性氧可以通過細胞空隙自由擴散進入線粒體,所以線粒體成為活性氧傷害的主要細胞器[1-6]。最近研究表明,線粒體在信號轉導中處于十分重要的地位。

1植物線粒體中活性氧的產生和性質

在線粒體的電子傳遞過程中,電子沿著一系列的電子傳遞體傳遞到末端氧化酶,然后再傳遞給氧,最后質子與離子型氧結合生成水。但是,位于呼吸鏈底物端的一些物質,如黃素蛋白、非血紅素鐵蛋白(non-heme iron proteins)、醌(qu-inols),尤其是半醌(semiquinols)等發生氧化還原的能障(en-ergy barier)是很低的,常常直接啟動O2的單電子還原(one-electron reduction),產生O2-。在電子傳遞給末端氧化酶之前漏出呼吸鏈與氧反應生成超氧自由基的過程是線粒體產生ROS的主要來源。一些酶系統通過細胞色素C氧化酶和交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)還原氧分子。在動物線粒體中黃素單核苷酸(FMN)和復合物Ⅰ中NADH脫氫酶的鐵硫中心是超氧陰離子產生的部位。復合物Ⅰ不僅能增加活性氧的含量,也能控制活性氧在整個細胞中的濃度;但復合物Ⅰ對泛醌即輔酶Q的過度還原會產生相反的作用,即形成大量的活性氧。在復合物Ⅲ中過度的還原也會產生大量的超氧化物陰離子(O2-)。

大部分超氧陰離子(O2-)在Mn-SOD的作用下可以有效地轉變成過氧化氫,然后過氧化氫與鐵或銅離子反應生成OH。鐵硫蛋白也可通過釋放鐵離子進行同樣的反應。同時,高分子和大分子成為其他活性氧攻擊的目標,例如,在膜脂或線粒體DNA合成過程中起作用:線粒體中的染色體是以染色質的形式存在,同時DNA修復的低頻率性使線粒體DNA比核DNA更易受到氧化損傷。惡劣的外界環境條件同樣會使植物體遭受氧脅迫,例如,病原體入侵,細胞凋亡,鹽脅迫以及大量金屬離子的累積都可以導致活性氧的形成。盡管活性氧使線粒體代謝失衡,但是它們構成了細胞內的信號通路,特別在細胞核DNA轉錄調控中起到了很大作用。

2線粒體蛋白組分析

線粒體中的生物系統與細胞質和葉綠體中的生物系統具有相似性,但植物線粒體也有自己獨特的特征。大規模蛋白質組學研究已經完成,該研究旨在闡明各細胞器中生物系統進化是否有相關性,特別是當處于脅迫情況下時它們之間的相關性[6,7]。許多線粒體蛋白被認為是過氧化酶的靶分子,并且一些蛋白以氧化的形式存在[8,9]。當氧化發生在半胱氨酸和甲硫氨酸時,氧化可以可逆的影響酶的活性,而且以此方式參與信號通路。當氧化發生在其他氨基酸時,肽鏈就會斷裂并且對蛋白酶的攻擊也就加強,這樣就會影響線粒體代謝。當蛋白質遭受氧化損傷時,在線粒體的提取物中可以發現蛋白質斷裂后的產物,同時線粒體中的多種蛋白質也會發生改變。在氧化脅迫情況下,三羧酸循環中的酶和含Fe-S聚簇的酶很可能是第1個作為氧化的靶分子遭受氧化損傷[10]。

3線粒體能量釋放系統

交替氧化酶(AOX)和解偶聯蛋白(UCP)是線粒體中2種能量釋放系統,它們由多基因家族編碼,具有不同的表達和調控方式。線粒體膜蛋白之間良好的協調關系將有助于它們減少由于電子傳遞鏈過度還原產生的活性氧。它們的調控很可能會影響三羧酸循環過程[11,12]。由于對AOXs和UCPs多樣性研究的逐漸增多,植物線粒體中它們的不同功能在不久的將來可能出現。它們在線粒體產生的氧化脅迫上能起到很好的保護作用,但不能阻止傷害的產生。

4抗壞血酸

抗壞血酸是一種小分子的抗氧化物,在植物細胞中具有很高的濃度,具有很強的抗氧化能力,通常濃度在10~100mg/L之間,但在特殊的情況下,濃度可高達300mg/L。因此,抗壞血酸在細胞氧化還原反應和代謝調控上起到了很突出的作用。抗壞血酸在線粒體以及細胞的其他部位均存在,濃度相當,但在葉綠體中的含量較多。而且與在其他細胞器中一樣,在線粒體中以還原態存在。現已經證實抗壞血酸-谷胱甘肽循環在線粒體中的存在,并且可以調節自身內部過氧化氫的濃度,其中谷胱甘肽(glutathione,GSH)、抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydro-ascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)均存在于線粒體基質中,單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)則存在于線粒體膜上[13,14]。抗壞血酸進入線粒體的形式至今沒有得到證實。但需要注意的是催化合成抗血酸的酶定位于線粒體內膜上(Bartoli et al.,2000)。在線粒體的膜間隙中抗壞血酸合成,被氧化后進入基質中,進入循環后被還原,接著在APX催化下還原型的抗壞血酸將過氧化氫還原成水,同時ASA變成DHA;DHA通過循環,在2分子GSH作用下被還原成ASA,同時GSH被氧化成GSSG。

5酶促ROS清除系統

5.1SOD和過氧化氫酶(catalase)

線粒體基質中含有Mn-SOD,它催化超氧陰離子自由基還原成過氧化氫,同時Mn-SOD也保護著基質中可溶性酶被超氧陰離子氧化。但是生成的過氧化氫的清除機制仍不是很清楚。

5.2GSH和硫氧還蛋白(TRX)的線粒體系統

GSH在線粒體基質中的濃度高達107 。在線粒體脊發現了GSH還原酶,但是人們仍然認為GSH合成通路不存在于線粒體中。在細胞器之間的間隙存在GSH存儲池,不同的載體可以從細胞溶質中吸收GSH來維持GSH的含量。GSH可以保護蛋白免受氧化損傷。GSH的不可逆內收保護了半胱氨酸免受過氧化的損傷。由于谷胱甘肽化的蛋白質沒有活性,因此,谷胱甘肽化的蛋白質成為氧化脅迫的一種調節方式。在動物線粒體中,GRX調節谷胱甘肽化和非谷胱甘肽化。目前,GRX在植物線粒體中還沒有被正式認定,但是幾種序列都支持線粒體的轉運肽,而且可能這些蛋白質現在存在于線粒體中[15]。

5.3GRX和TRX在線粒體中的靶分子

隨著植物中GRX和TRX系統的發現,對它們作用對象的尋找和分析以及它們在器官和分子水平上的作用成為日益關注的問題。TRX系統不僅與在細胞的組成物中發現的物質具有相似性,而且還與一組特殊的線粒體酶相互作用。由于半胱氨酸標記方法,單半胱氨酸GRX和TRX突變體的應用,雙向電泳和熒光探針,使它們得到了證實。對分離多肽的光譜測定,鑒定了GRX和TRX的靶分子。TRX很可能以多種方式調節著很多種線粒體酶。在不同的靶分子中,區別酶分子的不同是可能的,此需要TRX具有催化作用和再生功能,最重要的是具有氧化還原酶和底物酶。

第1類不依賴TRX的酶有:過氧化物還原酶(peroxi-redoxins,PRXs)、核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase)、蛋氨酸亞砜還原酶(methionine sulfoxide reductase,MSR)、植物的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidases,GRXs)。MSR存在于人類的線粒體中,而在植物中至今沒有發現。PRX幾乎存在于所有細胞中。植物的PRX通常有4種類型,即PRXⅡ、2-CysPRX、1-CysPRX和PRXQ,其中PRXⅡ是最大的一種,從生物體和細胞水平上考慮,GSH或GRX或TRX均可以單獨還原PRXⅡ;2-CysPRX存在于哺乳動物組織細胞的線粒體中,但在植物中卻沒有報道。除了上述的4種類型外,最近又發現了第5種不依賴TRX的過氧化物酶,它屬于GPX蛋白;在植物中GPX蛋白很可能與TRX作用而不與GSH作用,并且從序列分析得知,植物線粒體中至少含有它的1種異構體。通過綠色熒光蛋白融合技術,在活體外部觀察到了GPX存在于線粒體中,是細胞質或葉綠體的TRX還原了線粒體的電子供體而不是線粒體本身的TRX還原的[14,15]。這樣,就像其他細胞中的一樣,PRX家族和其伴侶在線粒體中形成了一個很復雜的網絡結構,以調控不同環境中ROS的濃度變化;另外,它們很可能在氧化還原和信號轉導上起作用,還需要進一步研究。

線粒體中有一類可以被TRX調控的蛋白質,這些蛋白質作為TRX的靶分子,其存在于許多代謝過程中,包括檸檬酸循環、光呼吸作用、脂肪酸代謝、激素調節過程、硫或氮代謝、轉運調控和蛋白組裝上。PCD中的與滲透性轉變小孔形成有關的陰離子通道載體是最有意義的靶分子,但是研究最多的靶分子是AOX。在電子傳遞鏈上,AOX是一種鐵蛋白,催化氧氣還原為水,同時泛醌被氧化,但是不形成三磷酸腺苷。當線粒體處于脅迫時,AOX可以阻止泛醌的過度還原,減少超氧陰離子自由基的產生和氧化脅迫。AOX以2分子復合物的形式存在,錨定于線粒體內膜,有保守的半胱氨酸,當2個半胱氨酸被氧化形成二硫鍵,發生二聚化,即酶失活[14,15]。以上這些都說明,在線粒體基質中,存在一個交叉點,可以將TRX調控系統和ETC的氧化還原狀態與線粒體膜聯系起來。

6結束語

由于科學的進步和新的實驗方法的出現,使得人們對線粒體的認識正在逐步深入。這些都歸于從不同植物,甚至從模式植物中純化線粒體方法的提高,在蛋白質組學的研究上也出現了新的方法。因此,對線粒體中各種代謝途徑與抗氧化關系的研究將是以后研究的方向。

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