微生物致病菌快速檢測技術

張華鋒

摘要:從原理、特點及應用等方面對食源性微生物致病菌的免疫及分子檢測新技術作一概述,期望為致病菌監測提供參考。

關鍵詞:致病菌免疫學聚合酶鏈反應基因芯片

食品中的生物性污染無論是在發達國家還是發展中國家都是影響食品安全的最主要原因,致病性微生物是對消費者健康危害最大的食品安全問題。要確定食源性微生物致病菌在食物鏈中相關的食品,尋找預防食品污染的關鍵環節則依賴于對致病菌的監測能力和水平。

傳統的檢測方法無法對難培養或不可培養的致病菌進行檢測,而且耗時費力,獲得結果通常需要幾天的時間,不能實現有效的監測、預防作用。因此,發展新的快速檢測與鑒定食源性致病菌的方法是及時有效地控制和預防致病菌傳播的前提。本文從原理、特點及應用等方面對食源性致病菌的免疫學及聚合酶鏈反應、基因芯片等檢測新技術進行綜述。

1. 免疫學檢測技術

免疫學檢測技術將抗原、抗體反應的特異性與酶的高效催化作用相結合,是一種可以定位、定性和定量的綜合技術,具高專一性和高敏感度。

1.1 酶聯免疫吸附檢測(ELISA)。1971年Engvall建立了ELISA方法,它以酶或者輔酶作為標記物,標記抗原或者抗體,用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應,并且利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原或者抗體,使其固相化,在其中進行免疫反應和酶促反應。ELISA具有選擇性好、結果判斷客觀準確、實用性強、樣品處理量大等優點,彌補了經典化學分析方法和其他儀器測試手段的不足。但ELISA對試劑的選擇性高,很難同時分析多成分;對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應;對分析分子量很小的化合物或很不穩定的化合物有一定的困難。

1.2 免疫磁性分離技術。免疫磁性分離技術是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面,與樣品中被檢致病菌發生特異性的結合,載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下,向磁極方向聚集,棄去檢樣混合液,使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術代替了常規的選擇性增菌培養過程,可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。

1.3 免疫膠體金技術。免疫膠體金技術起源于1971年Faulk等應用電鏡免疫膠體金染色法(IGS)觀察沙門氏菌。其基本原理是以微孔濾膜為載體包被已知抗原或抗體,加入待檢標本后,經濾膜的毛細管作用或滲濾作用使標本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結合,再用膠體金結合物標記而達到檢測目的。其特點是單份測定、簡單快速、特異敏感、不需任何儀器設備和試劑,幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的實驗結果,并可保存實驗結果。

2. 聚合酶鏈反應(PCR)檢測方法

聚合酶鏈反應(PCR)是近十多年來應用最廣的分子生物學方法,在食源性致病菌的檢測中均是以其遺傳物質高度保守的核酸序列設計特 異引物進行擴增,進而用凝膠電泳和紫外核酸檢測儀觀察擴增結果。其中,依賴PCR的DNA指紋圖譜技術、多重PCR檢測技術(m.PCR)、定量PCR檢測技術等應用最為廣泛。

2.1 依賴PCR的DNA指紋圖譜技術。依賴PCR的DNA指紋圖譜技術是通過各種改進的PCR技術,使目標微生物的核酸經擴增后,產生多條DNA擴增片段(特異性和非特異性的),通過統計分析,找出某種微生物的特有條帶,進行區別鑒定。

2.1.1隨機引物擴增DNA多態 (RAPD)。隨機引物擴增DNA多態性主要用于不考慮微生物核酸精確序列的情況下,比較微生物間的DNA指紋圖譜差異,用于細菌種問的鑒定,Black等[8]將毛細管熱循環儀及RAPD技術用于李斯特氏菌(Listeria Pirie)的鑒定,3h即可出結果。Louie等比較了核酸分型技術、RAPD和脈沖場凝膠電泳技術,用于李斯特菌的分型鑒定,結果顯示后兩種方法效果較好。但是RAPD的不足之處是需對大量的隨機引物進行篩選,且有時擴增的條帶不很穩定。

2.1.2 基因內重復性一致序(ERIC)的擴增。ERIC片段是存在于腸道細菌核酸中的重復DNA序列,長126bp,含有一段高度保守的中心反轉重復序列,分布在細菌染色體的不同位點上且以不同的距離分隔,因此,以這些重復的DNA片段作為PCR擴增時引物的結合位點,使其被分隔的片段大量擴增,在凝膠電泳上形成一系列的條帶,從而區分不同的腸道細菌。Versalovio等[10]曾用與ERIC重復序列互補的寡核苷酸片段作為引物及斑點雜交DNA探針來檢測包括大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)等不同菌種間存在的特異DNA指紋圖譜。與RAPD相比,此法引用的引物序列固定,結果的重復性更好。

2.2 多重PCR檢測技術(m-PCR)。PCR技術已經運用于食品中單一致病菌的檢測, 并得到一定程度的推廣,但食品中往往含有多種致病菌。多重PCR的建立,實現了多種食源性致病菌的同時檢測。M.PCR是指在同一個反應體系中,加入多對特異性引物,如果存在與各引物對特異性互補的模板,即可同時在同一反應管中擴增出一條以上的目的DNA片段,實現了一次性檢測多種致病菌的目的。

我國學者嚴笠等[13]應用m.PCR,在同一擴增體系中同時擴增了大腸埃希氏菌O157:H7(Escherichia coli 0157:H7)、沙門氏菌(Salmonella spp.)和志賀氏菌(Shigella spp.)特征性基因,最后通過凝膠電泳實現了這三種致病菌的的同時快速檢測,取得理想結果。m.PCR既保留了常規PCR的特異性、敏感性,又減少了操作步驟及試劑。但也存在較明顯的不足:擴增效率不高、敏感性偏低;擴增條件需摸索與協調;可能出現引物間干擾等。

2.3 定量PCR檢測技術。定量PCR檢測技術是對傳統定性PCR技術的發展和補充,即在PCR反應體系中加入標記物,通過標記物的表達量,在定性的同時實現定量。

2.3.1 內標定量PCR。內標定量PCR采用終點檢測,即PCR到達平臺期后進行檢測,建立常規PCR經過對數期擴增到達平臺期時,檢測重顯性極差。因此,無法直接從終點產物量推算出起始模板量,而加入內標后,可部分消除終產物定量所造成的不準確性,達到定量。

2.3.2實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR技術無須內標物,而是在反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,有效地解決了內標定量PCR只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值(每個反應內的熒光信號到達設定的域值所經歷的循環數,Cycle threshold)計算,根據標準曲線得定量結果。實時熒光定量PCR將DNA擴增和分子雜交同步進行,且采用了閉管檢測,擴增后無須電泳,自動化程度高,減少了污染的可能性,提高了檢測的靈敏度和特異性。

3. 基因芯片技術

基因芯片(gene chip)是指按照預定位置固定在固相載體上很小面積內的千萬個核酸分子所組成的微點陣列。其檢測致病菌原理為:相關細菌的特異性基因(如毒力基因、抗生素耐受基因) 和基因庫中的rDNA序列設計玻片上的片斷,這種方法可以快速、準確地檢測和鑒定食物中的病原菌。

唐曉敏等利用此技術檢測水中常見致病菌,與傳統方法鑒定結果一致性為95%,并且對于一個未知菌落,可以在4h之內完成菌種判斷,為快速檢測與鑒定常見致病菌提供了有效的手段。

4. 討論

免疫學方法,不需復雜儀器,所需設備簡單、易操作。其中免疫膠體金快速診斷技術由于其無污染、便捷、靈敏、安全等特點逐漸有取代ELlSA等的檢測方法的趨勢,對致病菌的檢測有著相當大的應用前景。但免疫學方法一般需提供數量較多的純化細菌,或需對樣品進行濃縮后收集,以提高單位體積的含菌量,從而較難在短時間內得到檢測結果。許多快速檢測方法,在應用過程中有其所長和不足。總體來看,快速檢測方法在衛生檢驗方面目前尚存在有時定性與精確定量難以兼顧狀況。另外,每一種免疫學檢測模式都存在抗體與非抗原物質之間的非特異性反應,如檢測中特異性抗體與細菌增菌液、培養過濾物(含葡萄球菌A/G蛋白)或食品中某些成分(如溶菌酶E、單寧物質等)的結合,從而產生假陽性反應。此外,待檢抗原被樣品中一些物質或其它優勢菌群所掩蔽,會產生假陰性反應。為了避免這些誤差,可設置對照實驗進行證實。通常,可用合成肽或抗獨特型抗體特異阻斷IgG或用單抗特異性阻斷的方法減少假陽性;針對假陰性結果可以加入定量抗原到樣品中,以國際標準抗原樣品為準,進行對照,以此減少假陰性結果。在致病菌的分子生物學檢測方法方面,由于檢樣中存在死的致病菌、特異性DNA或RNA片段存在同源性和檢樣中存在不可培養微生物的情況等問題,常常造成PCR檢測結果與常規方法相比,陽性率變高的現象,除存在不可培養微生物的情況外,均屬于假陽性范疇,然而對假陽性問題,通常在實際食品檢測工作中,PCR檢測技術可作為大通量的快速檢測技術,對其中出現的極少數的陽性樣品,可采用傳統的方法加以印證,即可解決假陽性的問題。另外,非特異性擴增產物的出現、引物二聚體的形成、甚至凝膠電泳上無擴增帶,只出現一片模糊,也限制了PCR技術的應用,針對這些問題,結合熱啟動PCR和降落PCR有望進一步得到改進。目前,分子生物學方法是食源性致病菌檢測方法的主要發展方向,尤其是DNA指紋圖譜技術近年來得到快速發展。對于一種未知菌, 為了提高致病菌檢出率、縮短檢測時間、簡化檢測程序,一般先采用通用引物多重PCR技術鑒定出種、屬,再用DNA指紋圖譜技術進一步分型。而將生物芯片技術或多重PCR與熒光探針定量技術相結合,形成一套完整分子生物學方法,可使致病菌的檢測逐步向靈敏度高、特異性強、重復性大、簡易、經濟的方向不斷發展。

參考文獻:

[1]楊晉川,景懷琦,等.用免疫膠體金快速診斷卡初篩糞便中的O157:H7大腸桿菌[J].病毒檢測,2001,16.

[2] 仝文斌,高巍,費然,等.核酸擴增產物的量化酶免疫通用型檢測方法[J].中華醫學檢驗雜志,1999,22.

[3] 勒連群,李君文,王升啟,等.基因芯片技術檢測環境中常見致病菌的初步研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2003,23.