耐鹽基因Ｈａｌ１的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

沈　雁　陳　霞　陳　燕　龔　毅　陳宇光

摘要 以酵母菌株BWG1-7A基因組DNA為模板，利用PCR方法，擴(kuò)增出耐鹽基因Hal1，測(cè)序表明該基因全長(zhǎng)為885個(gè)核苷酸，與已發(fā)表的序列NC_001148比較，同源性99.3%。將該基因插入表達(dá)載體pYES2的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建表達(dá)載體pYES2-Hal1，序列測(cè)定完全正確，為植物表達(dá)載體的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 耐鹽性；Hal1基因；克隆

中圖分類號(hào) Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2009）07-0243-02

Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid

SHEN Yan1，2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2

（1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences，Shanghai 200233；

2 School of life Sciences，Shanghai University）

Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template，Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes，then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence，which provided a foundation of the construction of plant expression vector.

Key words Salt tolerance；Hal1 gene；Cloning

隨著全球水資源危機(jī)以及土壤鹽化問題的加劇，鹽脅迫已經(jīng)成為影響植物生長(zhǎng)、導(dǎo)致糧食和經(jīng)濟(jì)作物減產(chǎn)的主要限制因素[1]。目前，全世界大約有20%的農(nóng)業(yè)用地的鹽堿化程度在不斷加重，預(yù)計(jì)到2050年，將會(huì)有超過50%的耕地會(huì)變得鹽堿化[2]。在當(dāng)前世界人口急劇增長(zhǎng)、食品供給增長(zhǎng)相對(duì)緩慢的情形下，只有采取一定的措施應(yīng)對(duì)日趨嚴(yán)重的環(huán)境壓力，才能確保人類的食品安全，維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。為了達(dá)到這一目標(biāo)，就必須了解鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，弄清植物耐鹽的機(jī)制，并通過農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)手段改良農(nóng)作物，以增強(qiáng)它們的耐鹽性，使其最終為人類的生產(chǎn)和生活服務(wù)。耐鹽基因Hal1最初來源于啤酒酵母的第16號(hào)染色體，具有提高細(xì)胞中K+含量，降低Na+含量，也就是提高K+/Na+的比率[3，4]，從而可以提高細(xì)胞耐鹽性的作用。本研究成功克隆了耐鹽基因Hal1，并將它連接到pYES2表達(dá)載體上，測(cè)序表明其與已發(fā)表的序列比較，同源性99.3%，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-Hal1，序列測(cè)定完全正確，為下一步利用該基因提高生物的耐鹽水平提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

釀酒酵母BWG1-7A，大腸桿菌菌株DH5α，JM109，質(zhì)粒pYES2均為中科院上海生命科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室保存；KOD酶購(gòu)自TOYOBO公司，T4連接酶、BamHI和EcoRI酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成；其他化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母基因組ＤＮＡ的提取。將活化的菌種接種于YPD培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，收集菌體后用Lyticase 酶解酵母細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體，參照亞當(dāng)斯A等[5]采用SDS裂解酵母細(xì)胞，提取酵母基因組總DNA。

1.2.2 Hal1基因的擴(kuò)增。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中Hal1基因序列信息（序列登記號(hào)：NC_001148），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物（P1）為5′－CGCGGATCCAT GCATTTCAAAGATTTAGGATTGCATACTACACTC－3′， 下游引物（P2）為5′-CCGGGAATTCTCAACTATTCTGT GTTG－3′，下劃線分別代表BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。在20μL PCR反應(yīng)體系中加入模板DNA 1μL，10×反應(yīng)緩沖液2μL，2.5 mmoL/L dNTP 1μL，P1和P2引物均為5μmoL/L，KOD酶0.5IU，94℃預(yù)變性5min后，進(jìn)行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：94℃變性50s，53℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定。將Hal1基因的PCR產(chǎn)物和pYES2載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物分別回收，以1∶3比例連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐平板上。隨機(jī)挑取3個(gè)菌落（1，2，3），擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pYES2-Hal1。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hal1基因的PCR擴(kuò)增

利用引物（P1，P2），以釀酒酵母基因組總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了1條900bp左右的單一條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。

2.2 Hal1基因的克隆

將上述PCR產(chǎn)物酶切回收與pYES2連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將隨機(jī)挑取的菌落擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，第3號(hào)克隆酶切后電泳得到約900bp大小的片斷（見圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒pYES2-Hal1序列測(cè)定

進(jìn)而將3號(hào)克隆測(cè)序，結(jié)果顯示，該核苷酸序列與Genbank數(shù)據(jù)庫已報(bào)道的序列相比，同源性為99.3%（見圖3）。

3 結(jié)論與討論

釀酒酵母BWG1-7A具有較強(qiáng)的耐鹽能力，可在含有7%NaCl的YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。本試驗(yàn)通過PCR技術(shù)，成功地從其DNA中克隆到耐鹽基因Hal1。測(cè)定的陽性克隆序列，與GenBank上公布的Hal1基因相比較，其核苷酸同源性為99.3%。與已發(fā)表的序列同源，將為Hal1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化提供有力保障。

酵母菌的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和調(diào)控過程等都與高等生物具有一致性，因此已將其作為一種研究農(nóng)作物耐鹽機(jī)制的模式生物得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究采用的釀酒酵母，是分離耐鹽基因的有效模型，有助于高等植物耐鹽分子機(jī)理的研究，推動(dòng)抗?jié)B透脅迫工程的發(fā)展。

鹽堿地是巨大的潛在資源，綠化鹽堿地是擴(kuò)大耕地面積，進(jìn)一步發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境的重要措施。利用基因工程手段培育能在鹽堿地上種植的林木，是利用鹽堿地的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。釀酒酵母Hal1基因在鹽脅迫下能與促進(jìn)Na+外排的ENA1基因及其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)協(xié)同作用保持細(xì)胞內(nèi)低的Na+/K+比，以減輕Na+毒害，因而在植物耐鹽基因工程上具有很大的潛力[3]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 周和平，張立新，禹鋒，等.我國(guó)鹽堿地改良技術(shù)綜述及展望[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（11）：159-164.

[2]V INOCUR B，ALTMAN A. Recent advances in engineering p lant tolerance to a biotic stress： achievements and lim-itations[J].Current Opinion in Biotech-nology，2005（16）：123-132.

[3] R GAXIOLA，IF DE LARRINOA，JM Villalba，et al.A novel and conserved salt-induced protein is an important determinant of salt tolerance in yeast[J].EMBO，1992，11（9）：3157-3164.

[4] MARQUEZ JA，SERRANO R.Multiple transduction pathways regulate the sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt stress in yeast[J]. FEBS letters，1996（382）：89-92.

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[6] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al. T ransfer of the yeast salt to lerance gene HAL 1 to cucum isme cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Res，1997，6（1）：41-50.