攜帶人Endostatin基因的腺病毒治療胰腺癌移植瘤

呂純業 胡先貴 張怡杰 劉瑞 金鋼 邵成浩

攜帶人Endostatin基因的腺病毒治療胰腺癌移植瘤

呂純業 胡先貴 張怡杰 劉瑞 金鋼 邵成浩

目的觀察攜帶人Endostatin基因的重組腺病毒載體Ad-hEnd對裸鼠胰腺癌移植瘤的治療作用。方法將胰腺癌細胞株SW1990細胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型，隨機分為Ad-hEnd組、報告基因LacZ重組腺病毒組(Ad-LacZ組)和對照組，每組8只。重組腺病毒200 μl瘤內注射，隔日1次，共4次。觀察移植瘤的生長情況，免疫組化染色檢測血管內皮生長因子(VEGF)的表達和微血管密度(MVD)，原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測腫瘤細胞凋亡。結果移植瘤成瘤率100%。治療后4周，Ad-hEnd組、Ad-LacZ組和對照組移植瘤體積分別為(921.9±279.7)mm3、(2804.4±553.5)mm3和(3040.6±487.6)mm3；瘤重分別為(1.19±0.18)g、(2.38±0.42)g和 (2.41±0.47)g；VEGF表達陽性率分別為(36.3±7.1)%、(81.2±6.6)%和 (79.4±6.2)%；MVD分別為12±4、27±5和25±6；細胞凋亡率分別為(31.2±5.4)%、(9.4±4.9)%和(8.5±3.7)%。與Ad-LacZ組和對照組比較，Ad-hEnd組以上各項指標均有顯著性差異(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統計學意義。結論重組腺病毒介導的hEndostatin基因可抑制胰腺癌的生長和血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，可用于胰腺癌抗血管生成的基因治療。

胰腺腫瘤； 內皮抑素類； 腺病毒； 基因治療

腫瘤的生長、浸潤和轉移均依賴于腫瘤新生血管的形成，因此，抑制腫瘤血管形成可作為腫瘤治療的有效手段。胰腺癌并非是血管豐富的腫瘤，但其發生發展仍和血管生成密切相關。內皮抑素(Endostatin)是迄今發現的作用最強的內源性血管生成抑制劑[1]，本實驗在成功構建了攜帶人Endostatin (hEndostatin)的重組腺病毒載體基礎上，瘤體內注射治療胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，為利用腺病毒介導的人hEndostatin基因進行抗胰腺癌血管生成治療提供依據。

材料和方法

一、材料

pGEM-T-hEndostantin質粒由東方肝膽外科研究所薛惠斌博士構建(hEndostatin基因序列前加有M-成瘤蛋白信號肽，并經測序驗證正確)，hEndostatin重組腺病毒載體(Ad-hEnd)由我們前期構建[2]。AdEasyTM載體系統試劑盒為Stratagene公司產品，BJ5183菌株和293細胞為腺病毒載體試劑盒所帶，胰腺癌SW1990細胞系由長海醫院消化內科屠振興教授惠贈，DNA 限制性內切酶、T4DNA 連接酶為BioLabs公司產品，柱離心式小量膠回收試劑盒、DNA 抽提純化試劑盒為Qiagen公司產品，PCR試劑為上海閃晶生物公司產品，抗血管內皮生長因子(VEGF)一抗為福建邁新公司產品，EnVision免疫組化試劑盒為Daco公司產品。

二、裸鼠皮下移植瘤模型的建立及治療

健康純種SPF級BALB/C 4周齡雌性裸鼠24只，購自中科院上海實驗動物中心。對數生長期的SW1990細胞0.2 ml(4×106)注射于裸鼠背部右側皮下，1周后根據裸鼠荷瘤體積的大小，按系統抽樣法分為Ad-hEND組、LacZ重組腺病毒(Ad-LacZ)組和對照組，每組8只。5×109pfu/ml的重組腺病毒200 μl，沿腫瘤長徑多點多方向瘤內注射，對照組注射等量的PBS，隔日1次，共4次。每周用游標卡尺測量腫瘤的長徑(A)和短徑(B)，腫瘤體積(V)=A×B2×0.52[2]。治療4周后頸椎脫臼法處死裸鼠，切取腫瘤浸入等滲鹽水漂洗干凈，稱重后常規固定、石蠟包埋、切片。

三、免疫組化染色

常規性免疫組化染色。鏡檢觀察血管內皮生長因子(VEGF)的表達和微血管密度(MVD)。VEGF每組動物觀察8張切片，每張切片隨機取5個視野(10×40)，計算VEGF陽性腫瘤細胞占總細胞的百分數，取其均值。微血管計數采用文獻[3]方法，記錄4個視野內的微血管數，取其平均數。

四、原位缺口末端標記(TUNEL)法

腫瘤細胞凋亡采用TUNEL法。每張切片隨機取3個陽性視野(10×40)，計數500個細胞，計算凋亡細胞百分率。

五、統計學方法

結 果

一、裸鼠皮下移植瘤的生長改變

接種SW1990細胞1周后，接種部位長出大小約58 mm3的腫瘤，成瘤率100%。各組裸鼠皮下移植瘤均進行性增大，但Ad-hEnd組移植瘤生長速度顯著慢于其他2組(圖1，表1)。治療后4周，Ad-hEnd組移植瘤體積為(921.9±279.7)mm3，顯著小于Ad-LacZ組的(2804.4±553.5)mm3和對照組的(3040.6±487.6)mm3(Plt;0.01)；Ad-hEnd組瘤重為(1.19±0.18)g，顯著小于Ad-LacZ組的(2.38±0.42)g和對照組的(2.41±0.47)g (Plt;0.01)。Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

圖1 各組裸鼠SW1990細胞皮下移植瘤的生長曲線

二、移植瘤組織VEGF表達的變化

各組移植瘤均表達VEGF(圖2)，Ad-hEnd組移植瘤VEGF表達陽性率為(36.3±7.1)%，顯著低于Ad-LacZ組的(81.2±6.6)%和對照組的(79.4±6.2)%(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

三、移植瘤MVD的變化

Ad-hEnd組移植瘤MVD為12±4，明顯少于Ad-LacZ組的27±5和對照組的25±6(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

四、移植瘤細胞凋亡率的變化

Ad-hEnd組移植瘤細胞凋亡明顯增多，呈簇狀分布，而Ad-LacZ組、對照組僅有散在分布的凋亡細胞(圖3)。Ad-hEnd組移植瘤細胞凋亡率為(31.2±5.4)%，明顯高于Ad-LacZ組的(9.4±4.9)%和對照組的(8.5±3.7)%(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

表1 各組裸鼠SW1990細胞皮下移植瘤的體積和重量的變化

注：與其他2組比較，*Plt;0.01

圖3 Ad-hEnd組(A)、Ad-LacZ組(B)和對照組(C)腫瘤的凋亡細胞(TENEL ×400)

討 論

血管形成是惡性腫瘤生長和轉移的基礎，因此惡性腫瘤的治療應針對兩個不同的細胞群體：腫瘤細胞和血管內皮細胞。Endostatin是O′Reilly等于1997年從小鼠內皮瘤細胞的培養上清液中首次分離出來的，由膠原ⅩⅧ C末端單基因片斷編碼的184個氨基酸組成，是迄今發現的作用最強的內源性血管抑制因子，其重組蛋白已用于臨床，但由于生產費用昂貴、需長期全身用藥、治療劑量大、操作復雜及可能產生不良反應等缺點，目前尚不能普及。Endostatin局部給藥療效優于全身給藥[3]，若采用基因治療的方式將目的基因轉入腫瘤組織，使其可自分泌和(或)旁分泌血管抑制因子，不僅降低成本，還可在腫瘤局部造成藥物的高濃度，增強治療效果。

胰腺癌的血管生成也是血管調控因子失衡的結果[4]，可作為胰腺癌分化、轉移和預后分析的指標[5]。下調腫瘤細胞內源性VEGF的表達是Endostatin抗腫瘤的機制之一[6-7]，導入外源基因上調內源性血管生成抑制因子的表達以拮抗VEGF的促進血管生成作用，能顯著抑制胰腺癌的生長和轉移。由于Endostatin抑制血管生成以及腫瘤的生長和轉移均表現出明顯的量-效依賴關系，因而有效的基因轉移方法和轉移基因的高效表達是Endostatin基因治療的關鍵。質粒、脂質體等介導的Endostatin基因治療雖然在動物實驗中抑制了腫瘤生長，但由于轉染效率不高，抑瘤效應比Endostatin重組蛋白要弱，而應用高效的病毒載體介導Endostatin基因轉移的治療效果顯著優于重組蛋白[8]。

我們在前期研究中成功構建了攜帶人Endostatin的重組腺病毒載體(Ad-hEnd)，Western blotting分析證實目的基因可在腫瘤細胞內表達，所表達的hEndostatin蛋白顯著抑制雞胚尿囊膜血管生成，具有生物學活性。本實驗結果顯示，將Ad-hEnd注入胰腺癌移植瘤后顯著抑制其生長，抑瘤率達54.14%，同時移植瘤組織中VEGF的表達下降，MVD減少，腫瘤細胞凋亡率增加，表明靶向Endstatin的基因治療有一定療效。但轉染hEndostatin基因并不能完全抑制移植瘤生長，原因可能在于腫瘤血管形成受多種促進因子和抑制因子共同調節，胰腺癌細胞本身也能產生多種血管生成促進因子，hEndostatin基因轉染難以完全拮抗其作用。有研究證實Endostatin能增強肺癌的化療效果[9]，對化療不敏感的胰腺癌是否具有相同的作用尚有待繼續研究。

[1] O′Reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell,1997,88:277-285.

[2] 呂純業，胡先貴，邵成浩，等.重組腺病毒介導的人內皮抑素基因在SW1990細胞中的表達.中華實驗外科雜志，2007，24：1220-1222.

[3] Ziu M,Carrabba G,Bello L,et al.Antiangiogenic therapy by local intracerebral microinfusion improves treatment efficiency and survival in an orthotopic human glioblastoma model.Clin Cancer Res,2004,10:1255-1262.

[4] Schuch G,Kisker O,Atala A,et al.Pancreatic tumor growth is regulated by the balance between positive and negative modulators of angiogenesis.Angiogenesis,2002,5:181-190.

[5] Stipa F,Lucandri G,Limiti MR,et al.Angiogenesis as a prognostic indicator in pancreatic ductal adenocarcinoma.Anticancer Res,2002,22:445-449.

[6] Hajitou A,Grignet C,Devy L,et al.The antitumoral effect of endostatin and angiostatin is associated with a down-regulation of vascular endothelial growth factor expression in tumor cells.FASEB J,2002,16:1802-1804.

[7] Fukumoto S,Morifuji M,Katakura Y,et al.Endostatin inhibits lymph node metastasis by a down-regulation of the vascular endothelial growth factor C expression in tumor cells.Clin Exp Metastasis,2005,22:31-38.

[8] Liang ZH,Wu PH,Li L,et al.Inhibition of tumor growth in xenografted nude mice with adenovirus-mediated endostatin gene comparison with recombinant endostatin protein.China Med J(Engl),2004,117:1809-1814.

[9] 黃純，李凱，魏熙胤，等.晚期非小細胞肺癌循環血管內皮細胞水平的研究.中華腫瘤雜志，2006，10：780-783.

2008-08-21)

(本文編輯：屠振興)

Humanendostatingenerecombinantadenovirusforpancreaticcarcinomainnudemice

LVChun-ye,HUXian-gui,ZHANGYi-jie,LIURui,JINGang,SHAOCheng-hao.

DepartmentofGeneralSurgery,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

SHAOCheng-hao,Email:schhao@133sh.com

ObjectiveTo construct a human endostatin adenovirus vector and investigate its inhibitory effect on pancreatic carcinoma in nude mice.MethodsAnimal model of pancreatic carcinoma bearing nude mice was established by subcutaneous injection of SW1990 cells. All mice were randomized into Ad-hEnd group, Ad-LacZ group and control group with 8 mice in each group. The endostatin gene recombinant adenovirus were intratumorally injected every two days for 4 times. The rate of tumor growth was observed. Immunohistochemical staining was employed to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and micro-vessel density (MVD). TUNEL in situ was used to examine tumor cell apoptosis.ResultsThe tumor formation rate was 100%. 4 weeks later, the volumes of the tumors were (921.9±279.7)mm3, (2804.4±553.5)mm3and (3040.6±487.6)mm3in Ad-hEnd group, Ad-LacZ group and control group, respectively; the weights of the tumors were (1.19±0.18)g, (2.38±0.42)g and (2.41±0.47)g, respectively; the VEGF positive rates were (36.3±7.1)%, (81.2±6.6)% and (79.4±6.2)%, respectively; the levels of MVD were 12±4, 27±5 and 25±6, respectively; the apoptotic rates were (31.2±5.4)%, (9.4±4.9)% and (8.5±3.7)%, respectively. Compared with Ad-LacZ group and control group, the parameters in Ad-hEnd group were statistically different (Plt;0.01). The difference between Ad-LacZ group and control group was not statistically different.ConclusionsHuman endostatin gene mediated by recombinant adenovirus could inhibit tumor growth, angiogenesis and promote cell apoptosis of pancreatic carcinoma and could be used as gene therapy for pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasms; Endostatins; Adenoviruses; Gene therapy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.007

國家自然科學基金(30200275)；上海市青年科技啟明星計劃(05QMX1472)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院普外科

邵成浩，Email: schhao@133sh.com