水稻基因組DNA提取方法的研究進展

摘要：水稻基因組DNA的提取方法主要有SDS法和CTAB法。在此基礎上又提出了快速制備法、簡易提取法、無需液氮研磨提取法、微量提取法等多種方法。從試驗提取材料、方法等方面對以上各種方法的優缺點及應用范圍進行了綜述。

關鍵詞：水稻；基因組DNA；提取方法

中圖分類號：S511；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2010)04-0968-04

水稻是世界上最主要的三大糧食作物之一，已被列為模式作物，有著豐富和深入的基因組研究基礎。其DNA的制備是深入進行分子生物學研究的前提。為使所得DNA純度高，斷裂降解程度小、量足，在提取時應根據不同研究需要，保證其結構的相對完整性；盡量排除其他大分子成分如蛋白質、多糖等的污染。前人已就植物基因組DNA的提取總結了一系列的方法，如SDS法、CTAB法。但在DNA提取過程中，有機試劑處理次數過多，所得DNA分子片段偏小，純度不高，得率也低。且CTAB等試劑價格昂貴，增加了成本。目前，針對不同的研究目的和試驗需要，提取水稻基因組DNA的材料和方法的側重點不盡相同，各有其優缺點。

1 材料

目前提取水稻基因組DNA所用的材料主要有：水稻干種子、幼嫩莖段、葉片、幼穗老葉、發芽幼苗等。不同材料對提取的DNA純度和濃度以及所適用的范圍也不同。研究表明，植物組織中的多糖及其他一些次生代謝產物，如脂、萜等。會對DNA的提取造成很大的困難，而且這些物質的含量隨植物組織器官的生長而增加，如果不能有效地去除，植物組織中的酚類物質會氧化成醌，溶解在抽提液中與蛋白質、DNA結合。影響DNA的解鏈或降低Taq酶的活性。而使提取出來的DNA限制性內切酶無法酶切。所以，在DNA的提取過程中必須將酚類、多糖和蛋白質等化合物除去。為了避免上述物質的影響。在選取材料時，應盡可能挑取處于生長旺盛期的幼嫩組織。所以在以往的研究中大多數學者都以水稻新鮮葉片或幼苗或水稻幼嫩莖段作為提取材料。但在進行品種鑒定和純度分析時，用新鮮幼葉或幼苗提取DNA，不僅費時費成本，而且需要液氮。而用水稻單粒種子制備水稻DNA與幼葉相比較其操作簡便，省時省力且具有良好的重復性。一般來說DNA提取效果以愈傷組織和幼葉最佳，比如在采用剪切法提取DNA時，以幼穗為材料所提取的DNA純度比幼葉及老葉提取的質量要高，PCR效果較好。從所提取的DNA濃度和質量方面來比較，幼葉提取的DNA濃度較高，需要稀釋后才可用，而單粒種子所提取的DNA質量和濃度適中，DNA條帶清晰，沒有降解，可直接用于PCR擴增。

2 提取方法

2.1傳統提取法

2.1.1 SDS法這種提取方法利用高濃度的離子去污劑SDS使DNA與蛋白質分離，在高溫(55-65℃)條件下裂解細胞，使染色體離析。蛋白質變性，離心后除去沉淀。上清液用酚／氯仿抽提后用乙醇沉淀液相中的DNA。與CTAB法相比，SDS法步驟簡單，用時少，但DNA純度低，擴增效果差，也用到了一些對人體有害的試劑，安全性不高。但相對于其他快速簡易提取法，其步驟還是繁瑣、時間長。因此，不能滿足現代分子生物學研究中大批量組織DNA分析的需要。為此。有學者在SDS方法的基礎上提出了剪切法、液氮法和鋼珠法。這3種方法的步驟大致相同，原理相通，主要不同點在于對葉片的破碎方法。三者中剪切法和液氮法提取的基因組DNA的條帶亮度高，鋼珠法低。而且剪切法不需要研磨，不需要滅菌，節省時間，不用液氮研磨，節省成本，同時避免了研缽中殘留物的污染，提取的數量多，PCR結果穩定，重復性也好，所以經濟實惠，是實驗室提取水稻基因組DNA的一種好方法。在其操作步驟中，65％水浴過程很重要，時間過短，則DNA得率不高，時間過長則由于DNA酶的作用很容易造成DNA的降解。若只需少量的DNA，水浴時間可以縮短。水浴過程中要盡可能讓SDS充分與材料反應，盡可能完全地破碎細胞膜，釋放DNA，所以必須不時將反應體系輕輕顛倒混勻。

2.1.2 CTAB法CTAB法也是目前應用比較廣泛的傳統提取方法，其提取質量和產量都比較高。以水稻干種子為材料，采用CTAB法提取得到的DNA，經過純化和RNA酶處理，純度較高，顯示一條清晰的DNA帶：從RAPD擴增結果看，CTAB法獲得的模板DNA，每個引物均可擴增出清晰的條帶。但此方法操作非常繁瑣。耗時耗力，所用試劑對人體有毒，且成本較高。針對其操作繁瑣等缺點，在此基礎I-3L發展起一種快速簡單的方法，35 min之內提取到基因組DNA。該方法在CTAB抽提液的用量及加入氯仿／異戊醇離心的時間和次數等方面有所改進。它秉承了CTAB法高產率、高純度的優點，同時又大大簡化了CTAB法繁雜的操作過程。此方法操作簡單、快捷、經濟、可靠(能有效降低提取過程中基因組DNA的降解)，經電泳和PCR驗證，所提取的DNA其含量和純度與CTAB法所提取的DNA相當，所提取的DNA平均大小在23 kb以上，沒有明顯的降解，而傳統CTAB法所提取的DNA略有降解。

2.2快速制備法

2.2.1

煮沸法此方法只需取0.1 g新鮮水稻葉片于液氮中研磨，粉末懸浮于200μL TE緩沖液。在沸水上煮1-10min，冰浴10 min。于室溫下13 000r／min離心5 min。將上清儲存在-20℃中即可用于PCR。由于用的試劑少，因此成本較低。本方法可以用于轉基因植株的快速篩選，具有良好的重復性。

2.2.2微波爐法其步驟比較簡單，省時省力，只需取水稻葉片于液氮中研磨，粉末置于離心管里，蓋上蓋子，在700 w家用微波爐中高熱處理5 min，再加100 μL TE，振蕩，13 000 r／min離心2～5 min。將上清液儲存在20℃。即可用于PCR。該方法沒有用到SDS法，CTAB法中所用到的那些有毒試劑，因此安全性高，費用也較低。

2.2.3堿處理法采用堿處理水稻嫩葉，其浸出液直接用作PCR擴增的模板，擴增結果穩定、準確。與常規法提取的DNA擴增效果相比沒有顯著差異，用此方法制備的DNA室溫下2周之內、4℃下3周之內、-20℃下4個月以上擴增結果不變。所需試劑均為常規試劑，具有需要材料少、成本低、簡便、快捷等優點，尤其適合材料比較貴的轉基因水稻的預篩選和大量樣本的PCR，且擴增結果與CTAB法相比無差異。雖然堿處理的葉片浸出液中含有蛋白質等大量雜質，但似乎并不影響PCR引物與模板的結合。而且用浸出液直接作PCR擴增的模板，不需要改造的PCR緩沖液，對試驗條件要求也不嚴格，而擴增結果穩定可靠。也有試驗用此方法制備模板對水稻細胞質雄性不育系進行純度鑒定，發現效果良好。

2.3簡易提取法

此方法的特點是用NaOH溶液抽提基因組DNA，其DNA可以在短期內保存，在PCR分析中其效果與用常規CTAB法提取的DNA相當。本方法以DNA堿裂解法為原理，在大量預備試驗的基礎上，采用“一管兩步”——一個離心管。研磨、離心兩個步驟即可完成模板制備，儀器設備單一、步驟過程簡略，大大提高了樣品DNA的提取速度，每人每天可提取幾百個樣品，為能在短時間內進行大量樣品的PCR分析提供了條件，大大降低了DNA提取的成本，滿足了DNA提取的快捷省時、經濟有效且安全性高的要求。雖然本法提取過程十分便捷，但在提取過程中仍需注意，為了防止DNA片段的過度降解，材料搗碎要快速有力，并盡快加入等量的Tris-HC1(pH值為8)緩沖液，防止NaOH對DNA產生降解。同時，如果要保存樣品DNA，可吸取適量上清液到另一干凈離心管中，于20℃下貯存備用(可至少保存2個月)，以便重復PCR擴增或再次檢測鑒定，使試驗結果更加準確，且實用方便。

在上述方法上，研究者還提出了CS法，其材料、原理、試驗步驟以及所用儀器與上述簡易方法相同，只是用CS法提取DNA時比上述簡易方法少了一步在加入NaOH前的離心，但提取的DNA質量相當。

2.4無需液氮研磨提取法

2.4.1幼苗單株快速提取法本法可快速提取基因組DNA，無需液氮研磨、氯仿抽提，提取的DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，其質量也好，擴增結果穩定可靠，能滿足SSR-PCR的需要。由于其省略了液氮研磨、氯仿抽提等步驟，大大降低了成本和有害試劑對人體的毒性，且快速有效，可以在1d內提取大量樣品。使用本方法需要注意的是，由于沒有用酚、氯仿進行抽提。含有多糖、蛋白、色素等雜質，因此樣品的保存時間不宜過長，一般為2周左右，而且擴增時DNA用量不宜過多，否則會影響PCR效果；此外在提取過程中材料用量也不宜過多，否則容易造成提取失敗，一般以5-20 mg為宜。

2.4.2簡單快速，該方法提取DNA不需要液氮研磨、長時間溫浴及反復離心及對葉片進行剪碎、研磨等前處理等步驟，提取液只用到了NaOH和Tween20。所以就不需要太多的儀器設備，安全性高。此方法直接用0.2mL PCR管進行DNA的提取，而其他方法一般都用1.5 mL離心管提取，要進一步提高效率很難。它通過簡單的加熱、稀釋等操作便能制備100個PCR反應的DNA模板，1 h能提取96個樣品的DNA。克服了常規DNA提取過程比較復雜且費用高的缺點。

2.4.3單粒種子提取前面所提到的兩種方法雖然沒有液氮研磨，氯仿抽提等步驟，但卻用到了SDS和CTAB等有毒化學藥品。而此方法不用液氮研磨，不用氯仿、SDS、CTAB等有毒化學藥品。只用到了NaOH和HC1試劑，所以費用便宜也安全，且用量小，無需離心，不需要更換離心管，大大降低了提取DNA的成本。試驗步驟少，簡單，省時，試驗表明其提取的DNA適用于轉Bt基因水稻檢測，也適合于SSR擴增的要求，可用于種子真實性和純度的快速鑒定。是一種適合于大批量的單粒種子DNA提取方法，這對于用分子標記方法檢測種子純度特別適用。

2.4.4 TritonX-100法與NaOH提取法這兩種方法，即不需液氮速凍研磨，也均不接觸有毒試劑，可快速地制備水稻基因組DNA，用于SSR、STS等檢測，效果穩定可靠。其中TritonX-100法提取的基因組DNA具有很好的完整性。可用于后續其他分子生物學操作。NaOH法提取的基因組DNA降解嚴重，要及時用于PCR操作。經檢測，前者的OD值平均約為1.64，后者約為1.90；說明前者在一定程度上受到蛋白質的影響，而后者則排除了蛋白質污染。電泳顯示，TritonX-100法提取的DNA電泳條帶非常集中，表明該DNA很完整，而NaOH提取的DNA未見明顯條帶。呈彌散狀，表明DNA已經嚴重降解。這兩種提取法步驟相似，相對比較簡單，只是剛開始加的試劑不同。NaOH法加入了Tris-HC1和NaOH，而TfitonX-100法除了加入Tris-HCl和NaCl，還加入了TritonX-100。這兩種方法都是在離心管內勻漿植物材料，不需要液氮研磨，占據空間小，條件寬松，價格低廉，實際操作性很強，可同時快速處理多個樣品。而且勻漿后不用轉管，也避免了材料的損失和污染，因此尤其適用微量材料的DNA提取。用這兩種方法提取DNA時，都需注意材料搗碎的程度，搗得太碎，雖然DNA釋放更徹底，但一些影響PCR擴增效果的干擾因子也增多，擴增效果反而不好。要適度把握，以有可辨組織小塊為宜。若耍獲得較大量的上清液，離心之前可用不銹鋼棒將組織小塊壓到管底，以避免離心后漂浮的組織影響上清液的吸取。此外。選擇幼嫩的材料可以提高提取的效率㈨。

2.5微量提取法

2.5.1微量法該方法使用了液氮，采用竹簽將葉片搗碎，應用了類似鋼珠法的提取方法。用此方法提取的水稻基因組DNA。外觀呈透明膠體，TE溶解后經紫外分光光度計檢測，其OD比值均為1.80-1.90，產率達到100 ng／μL，基本上沒有蛋白質的污染。另外其電泳圖譜顯示，所得的DNA分子量較大，為20 kb以上長度的片斷。且有較好的純度，電泳條帶較清晰。許多研究表明，在選取材料時，應盡可能挑取處于生長旺盛期的幼嫩組織，如幼嫩葉片和幼莖等材料，這時組織中蛋白質、多糖及酚類化合物都很少，并且由于細胞多數處于分裂期，DNA的產量也會很高。在研磨時不斷加入液氮可以減少DNA受到的機械損傷和核酸酶的切割，但在保證DNA最小程度受到損傷的基礎上應盡可能地充分研磨以破壞細胞壁，然后立即加入裂解緩沖液并置于65℃溫水浴中，并不時地將反應體系顛倒混勻，使植物細胞充分裂解，釋放DNA。此法經濟簡便，具有實驗室通用性。另外，在提取樣品通量和節省操作時間的基礎上分離的DNA質量及可靠性也有保障。完全能滿足分子生物學實驗的需要。

2.5.2篩選水稻突變體的DNA微量快速提取法這是一種高通量水稻DNA微量快速抽提法。該方法特別適用于精細作圖群體和大型突變體庫的篩選鑒定，不僅通量大、速度快，而且可以確保足夠的DNA濃度和純度。本方法采用96孔抽提板，強調高通量，尤其適用于大量樣品的篩選檢測。在遺傳群體檢測或突變體庫篩選時，如果是F2和M：代群體材料，除要求能快速提取大量DNA外，還要求有足夠含量的DNA。本方法符合這兩方面的要求，關鍵是把葉片剪成碎片后放入抽提板孔中的速度要把握好，其他從加入提取液到DNA沉淀所需的時間與一般的微量提取法沒有較大的差異。

3 小結

對于水稻基因組DNA的提取材料而言，幼葉是比較理想的材料。但研究者可根據不同的試驗要求選擇不同的材料。在方法上，不同方法提取的DNA各有其優點。在純度和濃度方面，CTAB法是比較好的。在步驟簡要方面，簡化的CTAB法、剪切法、TritonX-100法、NaOH提取法等比較好。但在安全方面，不用有毒藥品的就比較理想，例如上面提到水稻單粒種子DNA的快速制備。而對于對DNA純度要求不高的一些PCR來說，煮沸法及微波爐法等無疑是比較理想的方法。若需要少量的DNA。那微量提取法就比較實用。以上各種提取方法都存在一些優勢或缺點上的共性。所以研究者可以根據不同的側重點及試驗需要，選用不同的提取方法。