家蠶核型多角體病毒GD株空斑克隆株系的建立

摘要：以家蠶胚胎細胞系(Bm E-swUl)為病毒培養栽體。利用中性紅染色的方法對家蠶核型多角體病毒(Bm NPV)GD株進行了空斑克隆，經擴大培養，獲得了CD株空斑克隆株系。根據Bm NPV c01株基因組序列的單核苷酸多態性(SNP)分析，選出其中SNP位點較多的gcn2(General eontrol nondere-pressible 2)基因，用于驗證Bm NPv GD株空斑克隆株系的純粹性。分別從Bm NPV GD株和空斑克隆株的基因組中擴增gcn2基因，經pMD18-T克隆后測序；將兩株病毒的gcn2基因分別進行SNP位點分析。發現GD株grn2基因的潛在SNP位點有2個，而空斑克隆后的病毒株5條gcn2基因序列比較后均未發現多態性位點，說明空斑克隆株經純化后，病原基因組的純粹性獲得了提高，病原得到了純化。

關鍵詞：家蠶核型多角體病毒；空斑克隆；SNP住點：純粹性

中圖分類號：S884.5⁺1；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2010)04-0785-03

家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleo-polyhedrovirlls，Bm NPV)屬于桿狀病毒科，是在昆蟲病毒病中發現最早的一類病毒。家蠶受此病毒侵染后，于病程的后期流出膿汁，俗稱血膿病。長期以來，學者們致力于從基因、細胞水平研究病毒致病機理，期待徹底解決家蠶核型多角體病毒對養蠶業的影響。采用細胞空斑純化方法獲得遺傳上均一的病毒株系，可保證分子生物學試驗的準確性和惟一性，是深入探討病毒遺傳學和分子生物學特征的基礎。家蠶核型多角體病毒分布廣泛，不同株系的基因結構具有明顯差異，通過比較NCBI數據庫中BmNPV T3株和SC7株的序列得知。不同地區的BmNPV基因組序列存在一定的差異，齊義鵬等的研究發現，Bm NPV中國株和日本株的uy39基因差異較大；作者的前期研究也證實了不同株系BmNPV bro基因家族的構成差異顯著；由此可知，該病毒變異性較大。為保證其基因組學研究的準確性，本文以Bm NPV廣東分離株(GD株)為材料，進行了空斑克隆，以獲得純化的病毒株；通過對BmNPV重慶株(CQ1株)基因組進行單核苷酸多態性(SNP)分析，選出SNP位點較多的gcn2基因用于驗證Bm NPV GD株空斑克隆株的病原純粹性，即調查空斑克隆前與克隆后的病毒株中，這個基因的潛在SNP位點的變化情況。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Bm NPV病毒株與宿主細胞Bm NPV廣東株(GD株)由華南農業大學蠶病實驗室饋贈：家蠶胚胎細胞系(Bm E-SWUl細胞)由西南大學蠶學與系統生物學研究所細胞實驗室建立。

1.1.2試劑

Grace昆蟲細胞培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自PAA公司；細胞培養板購自Corn.ing公司；PCR產物回收試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司：克隆載體pMDl8-T購自TaKaRa公司；低熔點瓊脂糖、工具酶購自Promega公司。

1.1.3 PCR引物gcn2上游引物：5’-q'TCTGCCCATAGCGAGTG-3’；gcn2下游引物：5’-GACAACGCAGCATAGGGA-3’：由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Bm NPV空斑克隆方法接種Bm E-SWUl細胞于6孔細胞培養板中，待細胞均勻貼壁后。吸除培養基，加入病毒液，28℃吸附1 h后，吸除病毒液，加入含1％低熔點瓊脂糖和20％血清的培養基，封好培養板。28℃培養2-3 d。加入中性紅染液，28℃培養2-3 h，然后吸除染液，倒置細胞板，黑暗過夜，以使空斑顯現。空斑顯現后，挑出空斑，于培養基中培養1 h以上。4000 r／min離心10min，上清作為下一輪空斑純化的原液。經過4-6輪的空斑純化，可形成Bm NPV GD株空斑克隆株系。

1.2.2 Bm NPV基因組的提取采用堿裂解法進行提取。

1.2.3 PCR反應PCR反應體系為25μL，在Ep-oendorf儀上進行PCR反應，反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s.53℃退火1 min，72℃延伸2min.30個循環；72℃延伸10 min，4cC保存。

1.2.4單核苷酸多態性分析

氨基酸序列翻譯采用BioXM2.0軟件進行處理，序列比對分析采用ClustalXl.83軟件進行。

2 結果與分析

2.1 Bm NPV GD株空斑克隆株系的建立

利用中性紅染色的方法進行空斑純化，活細胞著色，感染細胞不著色，染色4-5 d后，得到分離良好的空斑(圖1)，用槍頭挑取空斑，放人150μL含有10％血清的培養基中.28℃培養1 h以上，4 000r／min離心，取上清，作為下一輪空斑純化的原液。經過5輪純化并感染家蠶胚胎細胞(Bm E-SWUl)擴大培養后(圖2)，獲得了Bm NPV GD分離株空斑克隆株系(簡稱PC-GD株)。

2.2 Bm NPV空斑克隆株與GD株，qcn2基因的SNP分析

將克隆測序得到的GD株與空斑克隆株的共7條gcn2基因序列，采用Clustalx軟件進行了比對分析，結果如圖3所示。從圖3顯示，GD株gcn2基因有兩個差異位點，空斑克隆株gcn2基因未發現差異位點。測序峰圖顯示，測序比較準確，這兩個差異即為潛在的SNP位點，GD株兩個SNP位點分別引起了其氨基酸序列的變化(圖4)，但其氨基酸性質未發生變化。皆為非極性氨基酸。

3 討論

病毒的生存繁殖容易受到周圍環境的影響，且增殖迅速。變異幾率相應增高。已有研究表明，不同地區或不同株系的Bm NPV變異比較大，容易出現多株混雜的情況，多種基因在不同病毒株存在一定的變異，特別是bro基因在不同的病毒株有不同的拷貝。因此，針對特定株系的特定基因進行研究時，病毒材料的純度就顯得較為重要。本文以家蠶胚胎細胞系(Bm E-SWUl)為病毒培養載體，利用中性紅染色的方法進行了Bm NPV GD株的空斑克隆，結果顯示為活細胞著色、感染細胞不著色；通過細胞病變形成空斑，經過5輪純化并感染家蠶胚胎細胞系(Bm E-SWUl)擴大培養后，獲得了BmNPV GD分離株空斑克隆株系(簡稱PC-GD株)。將空斑克隆前后兩株病毒的gen2基因進行比對分析后發現，GD株gcn2基因有2個潛在的SNP位點，且這兩個SNP位點分別引起了其氨基酸序列的變化。即導致了非同義突變，而空斑克隆株5條gcn2基因序列則未發現SNP位點。這一結果表明，經過空斑克隆之后。病毒株基因組的純粹性(均質性)獲得了提高，病原得到了純化，可以用于開展其基因組內部基因的研究工作。

由于家蠶核型多角體病毒自身結構與生命活動的特點，其研究成果具有重大的理論和應用價值；獲得均一性較高的病毒株。是保證其生物學試驗準確性的前提。但常規空斑技術費時費力，整個純化流程約需30-60 d，還需要不斷地優化條件，縮短操作流程，以提高研究的高效性。而利用細胞空斑技術，能有效地分離出遺傳性穩定的病毒株或突變株，這對于進行病毒的毒力測定及分子生物學研究都有重要的意義。對家蠶病毒變異株進行分離，如果用稀釋法或勾單個多角體喂蠶或感染細胞，則工作量大，且可操作性差，感染率很低：采用空斑純化法后，不但病毒的定量可以更精確地進行，而且遺傳上均一的病毒純系化和變異株的分離也成為了可能。另外，通過空斑技術純化混合感染的重組病毒株是研究病毒基因重組的基本方法，無論是在診斷、分型、遺傳學等領域，還是在疫苗研制上，都是一個有前途的技術發展方向。