蕓薹屬ANR(BAN)基因家族RNA干擾載體的構建

摘要：花青素還原酶(ANR)是原花青素生物合成的關鍵酶，對種皮色素的積累起重要作用。黃子是油萊的重要優質性狀，但甘藍型油菜中其基因型缺乏，表型不穩定，分子機理不清。該實驗克隆了蕓薹屬ANR基因家族的RNA干擾片段BANRI，將其反反片段、正義片段采用NcoI+AatII、BamHI+Xbal分別插入到改進型植物RNA干擾基礎載體pFGC5941M的啟動子與間隔區、間隔區與終止子之間，形成重組載體pFGC5941M—BANRI(簡稱為pBANRI)，復合PCR鑒定表明載體構建成功，并轉化根癌農桿菌菌株LBA4404，獲得工程菌株。pBANRI的構建有助于揭示蕓薹屬物種種皮色素合成的機理。探索對油萊等植物種皮色素進行分子育種的可能性。

關鍵詞：蕓薹屬；甘藍型油菜；原花青素；ANR(BAN)；RNAi；載體

中圖分類號：0782 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2010)04-0769-04

蕓薹屬(Brassica)植物甘藍型油菜(B.napus L.)是世界上重要的油料作物之一，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)親緣關系較近。在相同遺傳背景下，黃子油菜比黑子油菜具有種皮薄，出油量高，油和餅粕中色素、木質素含量低等優點，因此黃子性狀是油菜遺傳改良的一個重要目標。甘藍型油菜中不存在天然的黃子基因型，但通過遠緣雜交培育的黃子甘藍型油菜存在黃子表型欠穩定、一致性差的問題。

對擬南芥等植物的研究表明，主要種皮色素是原花青素(Proanthocvanidin.PA)，也叫縮合單寧。PA經公共苯丙烷一核心類黃酮一原花青素復合途徑而合成，先后涉及12個關鍵酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3，H、DFR、LDOXJANS、LAR、ANR、LAC)的催化反應和3種轉運蛋白(GST、MATE、ATPase)的胞內轉運，并有6種轉錄因子(WIP ZF、MYB、bHLH、WD40、WRKY、MADS)參與調控PA的合成與積累。花青素還原酶(Anthocyanidin reductase.ANR)位于花青素合成酶(ANS)的下游，將花青素轉化成表兒茶素(2，3一順式黃烷3-醇)。它是一類PA單體，隨即向液泡轉運并聚合成為縮合單寧，在擬南芥中ANR基因又被稱為BANYULS(BAN)基因，因為該基因突變后種皮積累花青素而顯紅色。擬南芥中缺乏LAR.ANR／BAN是PA特異途徑的第一個關鍵酶，而在其他多數植物中PA特異途徑的第一個關鍵酶是LAR。它在LDOX之前可直接將DFR的產物無色花青素轉變成2.3一反式黃烷3-醇，然后形成縮合單寧。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種轉錄后水平的基因沉默技術，相對于反義及共抑制技術，RNAi可獲得更高的基因沉默效率：構建可轉錄為dsRNA的植物表達載體轉化植物，可實現植物中目標基因的可遺傳的基因沉默，用于基因功能鑒定和創造分子育種新材料。

此前本課題組采用RACE技術已經克隆了甘藍型油菜ANR基因家族(BnANRI至BnANR4)、白菜ANR基因家族(BMNRI、BrANR2)和甘藍ANR基因家族(BoANRI、BoANR2)的全長cDNA和基因組序列。在此基礎上，本研究構建了蕓薹屬ANR基因家族的RNAi載體，將有助于揭示蕓薹屬物種種皮色素合成的機理，探索對油菜等植物種皮色素進行分子育種修飾的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1)植物材料：甘藍型油菜的一個黑子保持系5B的基因組總DNA和其生殖器官(蕾，花，開花后10、20、30 d的種子)混合總cDNA，由本實驗室制備。

2)菌株和質粒：大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5ct、根癌農桿菌菌株LBA4404由本實驗室保存，RNA干擾載體pFGC5941(AY310901.1)的DH5ct菌株購自俄亥俄州立大學擬南芥生物資源中心。pFGC5941M是由本課題組在pFGC5941的基礎上改進而成，改進之處是采用來自甘藍型油菜的BnPAP2基因第2內含子(BnPAP2／2)替換了pFGC5941上過長的PhChsA間隔區，并在間隔區與啟動子間增加了一個AatⅡ切點，使載體構建和鑒定更方便，更有把握高效地介導目標基因的沉默。

3)試劑：pMDl9-T載體、DNA Ligation Kit Ver.2.0、λ-HindⅢDNA marker為大連寶生物(TaKaRa)產品。Easy-Taq DNA聚合酶及Buffer、dNTPs、DL2000 plus DNA marker、瓊脂糖等為北京全式金(Transgen)產品。Biospin膠回收試劑盒、Biospin質粒小量提取試劑盒為杭州博日(BioFlux)產品。限制性內切酶及Buffer為MBI Fermentas產品。引物(表1)合成和測序由上海英駿(1nvitrogen)商業完成。氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、鏈霉素(Str)等試劑購自上海生工。

1.2 蕓薹屬ANR基因家族干擾片段的擴增

以5B總cDNA為模板，采用引物組合FBAN，RI+RBANRI擴增蕓薹屬ANR基因家族干擾片段BANRI，50 IxL標準PCR體系含0.5μL模板和1.5UEasy-Tax／DNA聚合酶，反應條件為：94℃預變性2min；94℃變性1 min.58℃退火1 min.72℃延伸1min，30個循環；最后72℃延伸10min。電泳照相后，切膠回收目的條帶，與pMD19-T連接重組為DMD19-T-BANRI，轉化DH5α，PCR陽性的克隆子菌液送樣采用M13F測序。

1.3 蕓薹屬ANR基因家族RNA干擾載體的構建與鑒定

取DMD19-T-BANRI和DFGC5941M質粒，均進行Nco I+AatⅡ雙酶切至完全，電泳后分別回收反義片段BANRIA和開環的oFGC5941M骨架，采用T DNA連接酶將二者于16℃連接12h、得到重組質粒pFGC5941M-BANRIA，轉化DH5α，菌液PCR陽性的單克隆提取質粒。

采用BamH I+Xba 1分別對pMDl9-T-BANRI和pFGC5941M-BANRIA進行完全雙酶切，電泳后分別回收正義片段BANRIS和開環的DFGC5941M-BANRIA骨架，采用L DNA連接酶將二者于16℃連接12 h，得到重組質粒pFGC5941M-BANRI，轉化DH5a，對克隆子菌液進行復合PCR檢測，陽性克隆子即為蕓薹屬ANR基因家族RNA干擾載體。

1.4 工程菌株的獲得

從鑒定無誤的大腸桿菌單克隆菌液中抽提pFGC5941M-BANRI質粒，用液氮冷激法轉化根癌農桿菌LBA4404(感受態細胞制備同DH5a).LB平后，除T載體條帶外，產生了與預期683 bD一致的條帶，另有一條500 bp左右的雜帶，特異回收該683 bp的反義片段，記為BANRIA(圖2A)。pFGC5941M經NcoI+Aα完全雙酶切，得到了開環的載體骨架(圖2B)，回收。BANRIA與pFGC5941M骨架連接，得到pFGC5941M-BANRIA轉化DH5a，抗Kan單克隆菌液采用引物組合RB-nPAP212+RBANRI和F35S3N+FBANRI進行PCR鑒定，分別擴增出了與預期864 bp和801 bp一致的條帶(圖2C)，說明反義片段已按正確方向插入到啟動子與間隔區之間，形成了中間載體pFGC5941M-BANRIA。

采用BamH I+Xba I對pMDl9-T-BANRI和pFGC5941M-BANRIA質粒進行雙酶切，前者產生了與預期695 bp一致的正義片段BANRIS(圖2D)。后者產生了與預期一致的pFGC5941M-BANRIA開環骨架(圖2E)，回收二者，連接重組，得到干擾載體pFGC5941M-BANRI。轉化DH5ct。抗Kan單克隆菌板和單克隆菌液均采用Kan(100 mg／L)、Rif(40mg/L)和Str(20 mg/L)三重篩選，菌液PCR鑒定同1.3，陽性單克隆培養后作為植物轉化的工程菌株。

2 結果與分析

2.1 蕓薹屬ANR基因家族干擾片段的克隆

引物組合FBANRI+RBANRI擴增5B總cDNA模板后，PCR產物電泳后得到一條與預期大小一致的特異條帶(圖1)。將其回收，與pMDl9-T連接，轉化DH5a，PCR陽性的2個單克隆菌液測序后實際長度均為697bp，序列一致，它對應于BnANR2基因，與其mRNA對應區段只相差4個堿基，估計是等位基因間的SNP差異所致(圖1)。

2.2 蕓薹屬ANR基因家族RNA干擾載體的構建與檢測

pMD19-T-BANRI經Nco I+AαⅡ完全雙酶切液采用引物組合FBnPAP212+RBANRI和ROC，ST5N+FBANRI進行檢測，擴增出了與預期878bp和816bp一致的條帶(圖2F)，說明正義片段已按正確方向插入到間隔區與終止子間。同時。對單克隆菌液還采用F35S3N+RBnPAP212和FBnPAP212+ROCST5N進行PCR。再次驗證反義片段和正義片段插入的位置和大小，結果分別擴增得到與預期968 bp和997 bp一致的片段(圖2G)。綜合PCR鑒定表明，BnANRIA片段在35S啟動子與間隔區之間反義插入，BnANRIS片段在間隔區與終止子之間正義插入，兩個片段的插入大小和方向均正確，表明RNA干擾載體pFGC5941M-BANRI(簡稱為pBAN-RI)構建成功(圖3)。

2.3 重組載體轉化根癌農桿菌及鑒定

提取2.2中鑒定正確的DH5ct單克隆的質粒，采用凍融法導入根癌農桿菌菌株LBA4404，獲得抗Karl、Rif和Str的菌落。抗性單克隆的菌液采用與2.2一樣的復合PCR鑒定，取得完全一樣的結果，表明干擾載體pBANRI已成功轉入到LBA4404中，載體結構保持完整，形成了工程菌株，可直接用于植物轉化。

3 討論

植物中普遍存在基因家族現象，RNAi既可用于對不同成員進行分別沉默，也可用于對整個家族進行有效沉默，因此基因沉默也可以作為功能基因研究和分子育種的重要工具：保守區構建的RNA干擾片段與靶基因的一致性即使低至72％左右，也仍然會介導一定程度的基因沉默。本課題組經過克隆和Southern雜交表明，甘藍型油菜只有4條ANR基因(RnANRl-BnANR4)，親本物種白菜有2條ANR基因(RnrANRl和BrANR2)，甘藍有2條ANR基因(BoANRl和BoANR2)，BnANRl、BnANR2起源于BoANRl、BoANR2；BnANR3、BnANR4起源于BrANRl、BrANR2；來自3個物種的8條ANR基因之間在全長mRNA水平的一致性介于83.5％。99.8％.RNA干擾片段BANRI與BnANRI、BnANR2、BnANR3、BnANR4、BrANRl、BrANR2、BoANRl、BoANR2在mRNA水平的一致性分別達到88.7％、99.4％、90.4％、98.2％、90.1％、98.2％、88.6％、100.0％，因此理論上推測干擾載體pFGC5941M-BANRI可用于甘藍型油菜、白菜、甘藍等多個蕓薹屬物種的轉基因，介導ANR基因家族的高效沉默。而且該載體不會引起對DFR等基因的非靶向沉默。

本課題組在將DFGC5941改進成pFGC5941M時引入的AatⅡ切點有助于在啟動子與間隔區之間插入干擾片段，但pMD19-T的TA克隆位點的M13F一側的500bp上游存在一個一AatⅡ切點，所以本研究在用Nco I+AatⅡ從重組oMD19-T載體上切下反義片段時，伴隨產生了一個500bo左右的載體片段，對目標片段的判斷和切膠產生了一些干擾。如果用pGEM-T系列載體代替pMD19-T系列，則不存在該現象，因為它們的AatⅡ位于多克隆位點中，酶切雖然會產生一個44bo以下的極短雜片段，但它不會妨礙對目標基因片段的判斷和切膠。