核酸疫苗的免疫機制及其在禽病防治中的應用

摘要：核酸疫苗是當今疫苗研究的最前沿領域，就核酸疫苗的免疫機制以及在家禽疾病防治中的應用進行了綜述。

關鍵詞：核酸疫苗；免疫機制；家禽；應用

中圖分類號：S852.4+3；S858.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2010)04-0985-04

隨著生物工程技術和分子生物學的發展，禽用新型疫苗的研究有了重要的進展，產生了許多新的具有良好應用前景的新型疫苗，其中核酸疫苗就是其中最為熱門的研究方向之一。

核酸疫苗，又稱基因疫苗。包括DNA疫苗和RNA疫苗，其中DNA疫苗又稱為裸體DNA疫苗或裸DNA疫苗，是指將含有編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA)與質粒重組后直接導人動物細胞內。并通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。本文主要就核酸疫苗的免疫機制及其在禽病防治上的應用作一綜述。

1 核酸疫苗的免疫機制

核酸疫苗的免疫機制主要有以下3點：一是核酸疫苗接種后，被結合在游離核糖體上的mRNA翻譯而表達，合成的內源性抗原蛋白其中一部分以有效的比例結合到泛肽上，進一步結合泛肽，呈遞到蛋白酶，降解為多肽，通過抗原肽轉運結構(TAP)運送到內質網腔，與MHC-I類分子以親和吸附方式形成聚合體，多肽MHC-I類分子聚合體通過內質網進人高爾基體，最終到達細胞膜的表面，誘發CD8+細胞毒性T細胞應答的產生。二是另一部分蛋白抗原從分泌它們的抗原遞呈細胞(APC)的細胞膜上進入MHC-Ⅱ類型途徑，進入MHC-Ⅱ類呈遞途徑的蛋白在溶酶體中水解，產生大約20-25個氨基酸的多肽，這些溶酶體和包含MHC-Ⅱ分子的囊泡融合。MHC-Ⅱ分子結合合適的多肽形成MHC異聚體，成熟的MHC異聚體在細胞膜表面和CIN+T細胞反應，引發體液免疫應答。三是有一部分抗原多肽遞呈給B細胞，使B細胞自身活化，產生特異性抗體，誘發體液免疫。另外遞呈后的CD~限制性T細胞(Th)活化、增殖可產生多種細胞因子，進一步促進和強化體液免疫和細胞免疫。核酸免疫后，還可以使肌細胞和抗原遞呈細胞被感染，從而使CD4+和CD8+細胞亞群活化，產生特異的免疫應答。以前曾認為該過程需要內源抗原的表達，但現在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I類MHC限制的CTL應答。胞內型的蛋白分子在與MHC I類分子結合后，是誘導細胞免疫的最好抗原形式。

2 核酸疫苗在禽病防治中的應用

2.1禽流感(AI)核酸疫苗

最初開展的禽用核酸疫苗的研究就是以流感病毒血凝素(HA)基因為模板進行的，主要用來評估DNA疫苗對雞的免疫保護。

Robinson等以禽流感病毒H7N7株血凝素(HA)基因的質粒DNA由不同免疫途徑接種雞，免疫雞可對致死劑量的H7N7株病毒產生50％的保護率。Kodihalli等用巨細胞病毒啟動子和雞B一肌動朊啟動子分別構建了H5亞型HA基因表達質粒，用基因槍免疫雞，對致死性H5病毒攻擊可提供完全保護。重要的是，HA-DNA疫苗對HA1氨基酸序列變異率達11％-13％(與原抗原相比)的致死性抗原攻擊交叉保護率仍達95％。KodihaUi等隨后發現，HA基因的DNA疫苗免疫過的雞對不同血清亞型禽流感病毒的攻擊也能獲得保護，但到目前為止，并沒有更進一步的報道。2000年，Kodihalli等研究了包含表達H5血凝素基因質粒和表達H7血凝素基因質粒的聯合DNA疫苗效果，以及表達H5亞型NP基因的DNA疫苗效果。結果顯示，單一劑量聯合DNA疫苗免疫雞可抵抗H5或H7兩種亞型的攻擊。但是，表達NP基因的DNA疫苗免疫雞對H5N8(同一亞型)毒株致死性保護率為50％，對H7N7(不同亞型)毒株致死性保護率為42％。這一研究結果表明，表達NP基因的DNA疫苗不能對機體提供有效保護。Luschow等的試驗結果表明。采用重組ILTV(傳染性喉氣管炎病毒)作為禽流感基因疫苗的載體是一種有效可行的方式。姜永萍等將密碼子及表達載體優化的H5亞型禽流感DNA疫苗質粒pCAGGoptiHA5以50μg和10μg劑量單次或加強免疫5周齡海蘭褐蛋雞。結果表明。pCAGGoptiHA5以10v，g加強免疫后，可以誘導商品蛋雞產生較高水平的HI抗體，并可保護免疫蛋雞不發生高致病性禽流感病毒攻擊后的死亡。

目前，我國研制的H5亞型血凝素基因DNA疫苗，具有良好的免疫原性，通過肌肉注射途徑即可達到對同源強毒攻擊的免疫保護，并能有效阻斷免疫保護存活雞機體的排毒。國內研制的H7亞型血凝素基因DNA疫苗，在極小的劑量下即可成功誘導免疫保護反應，并有效阻斷同源低致病力禽流感病毒在機體內的感染和排毒。美國的Webster等最近用核酸疫苗免疫雞，預防H5、H7禽流感。試驗表明，在H5亞型流感病毒之間，DNA疫苗交叉保護性好，免疫后檢不出抗體。而攻毒后出現高滴度的抗體，表明活化的T細胞是DNA介導免疫保護的主要機制。

2.2新城疫(ND)核酸疫苗

Sakaguehi等用雞做模型，試驗了編碼新城疫病毒F基因的質粒DNA疫苗的免疫，結果證明，免疫9周后體內有抗體的試驗雞都能抵抗致死劑量NDV強毒的攻擊。Sakaguchi等將編碼新城疫病毒F蛋白的環狀和線狀質粒DNA100μg分別肌肉注射1周齡雞。結果顯示，只有注射線狀質粒DNA的雞產生特異性抗體并受到保護。合理選用佐劑可以提高基因疫苗的免疫效果。陳吉祥等用天然磷脂脂質體包裹NDV HN基因的真核表達質粒DcHNMD，NA，免疫5周齡雛雞，1周后免疫雞體中的特異性HI抗體開始升高。至第六周空白對照組抗體為2，3010g2，裸DNA免疫組為4，0910g2，脂質體DNA免疫組為4，7510g2；用新城疫強毒F48E9攻擊后，未免疫組雞的存活率為27，28％，裸DNA免疫組存活率為81，82％，脂質體DNA免疫組存活率為90％，表明該質粒DNA被脂質體包裹后不僅增加了動物的特異性抗體產生能力，而且也可以增加動物對新城疫強毒的抵抗力。2003年。方維煥等將含新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表達質粒Dc DNA 3F的減毒鼠傷寒沙門氏菌ZJ111株(zJ111 pc DNA 3F)口服接種小鼠和雛雞。結果表明，利用該減毒株作為載體傳遞DNA疫苗具有相對安全性。顧惠明等通過ELISA、淋巴細胞轉化試驗檢測了核酸疫苗在雞體內的表達，發現表達產物作為抗原物質刺激機體產生了特異性應答反應，引起了機體特異性的體液免疫和細胞免疫，對新城疫強毒攻擊的保護率為75％。

2.3雞傳染性法氏囊病(1BD)核酸疫苗

2000年步志高等將IBDV D78株VP2基因插入真核表達質粒pCI CMV啟動子下游多克隆位點構成pCI VP2，用3周齡SPF雞進行DNA免疫。結果表明，VP2基因DNA免疫可誘導SPF雞產生中和抗體，并形成對IBDV超強毒株致死攻擊的免疫保護，雖不能阻止臨床發病及法氏囊病理損傷發生，但有可能減緩法氏囊病理損傷程度。2001年Chang等111’將IBDV標準強毒株(STC)的VP2、VP3和VP4基因插入表達質粒pCR3，1構成pCR3，1-VP234-STC，肌肉注射1日齡雞，試驗雞分為DI、D2、D3 3組，每組接種次數依次為1、2、3次(每次間隔1周)，在試驗雞3周齡時用IBDV標準毒株(STC)攻毒，觀察10 d，發現D2組免疫保護率達50％-100％，D3組達80％-100％，D3組表現出不同程度的法氏囊萎縮。Tsukamoto等使用CMV啟動子或者CMV／β-肌動蛋白嵌合體啟動子，構建了兩種可以大量表達IBDV VP2抗原的重組火雞皰疹病毒rHVT-cmvVP2和rHVT-pecVP2。rHVT-oecVP2在體外表達VP2抗原量大約是rHVT-emvVP2的4倍，可以誘導機體對致病性IBDV的完全保護，而rHVT-cmvVP2只有58％的保護。rHVT-pecVP2免疫雞的抗體水平可以持續增長16周。這些結果表明，HVT載體表達VP2抗原的量直接關系到疫苗的效力，并且可以誘導雞對致病性IBDV的終身保護。于漣等構建12種真核表達質粒，結果表明，編碼VP2基因的DNA疫苗僅能誘導很低水平的中和抗體，幾乎不能提供免疫保護；以pCI為表達載體的免疫效果優于pcD-NA3，這就提示DNA疫苗的免疫效果與VP2蛋白的構象、表達載體的調控元件和毒株差異等因素有關。Chang等將IBDV VP2基因克隆到真核表達質粒pCR3.1中，再用RT-PCR方法成功擴增，作為IBDV的DNA疫苗。結果表明，包含有VP2基因的DNA質粒免疫雞后可以有效地介導機體對IBDV的保護性免疫應答。

2.4 雞馬立克氏病(MD)核酸疫苗

我國最早研制雞馬立克氏病DNA疫苗的是李建偉等于1996年進行的，他們擴增MDV主要免疫基因(gB基因)的PUC19質粒并制成DNA疫苗，分別以200μg和500μg總劑量肌注免疫雛雞。試驗初步證明。MD DNA疫苗有明顯的免疫保護作用。丁巧玲等通過構建重組真核表達質粒pcDNA3-gB，將重組真核表達質粒分2組進行雛雞腿部肌肉注射，試驗發現2次用重組真核表達質粒免疫組的免疫保護率為75％：而先免疫重組表達質粒。后免疫rFPV組的免疫保護率僅為50％。說明MDV gB基因DNA免疫可以誘導雞體產生免疫保護，但rFPV不能對其加強免疫。Tischer等將血清I型MDV克隆到BAC20(細菌人工染色體)上免疫雞，發現DNA疫苗可以對雞產生保護作用，但其免疫保護力并不比傳統的疫苗高。2002年，Okamura等將新城疫融合蛋白F基因置于MDVI異B啟動子下，然后插入CV1-988C17株的VSIO基因構建了抗MDV和NDV效果很好的二聯重組體。

2.5 雞傳染性支氣管炎(舊)核酸疫苗

步志高等將ORF完整的IBV類M41株S2基因cDNA插入真核表達質粒pCl CMV啟動子下游多克隆位點。構成重組質粒pCISI，用于l周齡SPF雛雞的DNA免疫試驗。試驗結果表明IBVSI基因DNA免疫可誘導SPF雞產生特異的IBV中和抗體，并可有效形成阻止相同血清型IBV感染后機體排毒的免疫保護。Yu等通過同源重組的方式在FPV的TK基因中插入編碼序列，構建了可穩定表達IBV Ch3株的N蛋白C-端片段(119個氨基酸)的rFPV。并證明了表達的這119個氨基酸片段是宿主的保護性抗原，可以產生對不同IBV毒株的交叉保護性免疫。Wang等構建了包含IBV M41株SJ基因cDNA的rFPV(rFPV-S1)，并且評價了它的免疫潛力。最初用Western blot技術檢測出rF，PV-S1在體外有效表達S1，后來通過監測用rFPV-S1免疫過的雞群血清中IBV特異性的IgG和中和抗體表明，Sl在體內也可有效表達。這種重組病毒可以使機體產生抗IBV的保護性免疫，并能抵抗強毒株IBV M41的攻擊。

2.6 雞傳染性喉氣管炎(lR)核酸疫苗

孟松樹等[21]將分別構建的含有雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)王崗株gB、gC和gD基因的重組真核表達質粒及空載體質粒分組注射雛雞，攻毒后觀察免疫保護效果。結果表明，重組質粒誘導了免疫應答，免疫保護率達到79％。該基因疫苗可以作為預防ILT的一個補充。孟松樹等又將分別構建的含有ILTV王崗株gB、gC和gD基因的重組真核表達質粒及CPG DNA佐劑分組肌肉注射SPF雞，檢測了免疫后的抗體水平，并觀測了攻毒后的免疫保護效果。實驗結果顯示，CoG DNA佐劑和DNA疫苗聯合免疫后的抗體水平比單一使用DNA疫苗的要高，而佐劑組的發病率、死亡率均低于非佐劑組，保護率則高于非佐劑組。

2.7雞球蟲核酸疫苗

現有報道的球蟲重組抗原有5401、GX3202、S07、MZ5-7、Etp28等，其中Bhogal等用活的大腸桿菌表達重組蛋白GX3262來免疫雞，對柔嫩艾美耳球蟲(E，tenellal)和變位艾美耳球蟲(E，acervulina)感染雞產生了部分保護作用。吳紹強等將柔嫩艾美耳球蟲

(E，ten，ella)BJ株保護性抗原基因TA4與Etbi基因串聯后插入到核酸疫苗載體ocDNA3，1中，然后用重組質粒免疫雞。結果證明，極少量的質粒DNA(50μg)就能產生良好的免疫效果，可刺激T淋巴細胞增殖，產生免疫保護。抗球蟲指數(ACI)在160以上。用Etmic-2和ta4兩種基因的表達產物經口服、肌注免疫雞，然后用柔嫩艾美爾球蟲攻擊免疫雞，兩種重組表達產物均對E，tenellal球蟲有一定的免疫保護作用。Lillehoi等發現用編碼-E.ac-ervulina(3-1E)的cDNA皮下注射雞，其表達的蛋白3-1E可刺激雞產生高滴度的INF-v，如將3-lEcDNA和編碼INF-γ及IL-15的cDNA一起免疫雞，其保護效果更為明顯。有試驗證明，將細胞因子與球蟲基因聯合插入到核酸疫苗載體中構建成免疫調節型DNA疫苗，產生的免疫保護效果要明顯優于單獨構建的DNA疫苗，且細胞因子對DNA疫苗的作用效果與細胞因子的選擇和劑量有關。3結語

核酸疫苗以其制備簡便、性質穩定、使用方便、易于保存與運輸等優點逐漸顯示了廣闊的應用前景，但尚處于研究探索階段，還存在一些問題，如免疫反應低以及安全性等，但隨著研究的不斷深入，這些問題將逐步得到解決，核酸疫苗也將大量應用于實際生產中，為畜牧業的健康發展提供有力保障。DNA疫苗適于多個物種，可通過胚胎免疫，也可通過局部免疫在禽類體內發揮重要的作用，禽類DNA疫苗免疫研究才剛剛起步，隨著對DNA疫苗研究的深入，新的疫苗種類將不斷被研制出來。DNA疫苗為預防禽病展示了美好的應用前景，將成為預防和控制禽類傳染病的主要疫苗之一。