BE-91菌株木聚糖酶活力測定條件的優(yōu)化

摘要：采用單因素試驗法和正交試驗法對BE—91茵株木聚糖酶活力測定條件進行系統(tǒng)研究，獲得優(yōu)化的木聚糖酶活力測定條件為：按1／9的比值添加稀釋100倍的木聚糖酶與預熱至62℃的濃度為O，8％的木聚糖底物(用pH值5.4～5.6的0.1 mol／L檸檬酸一檸檬酸的緩沖溶液配制)，62℃水浴準確反應3 min。加入2.0mL DNS溶液，沸水浴顯色10min，測定波長為540 min。在此優(yōu)化條件下，測得BE-91菌株木聚糖酶活力達350.24 U／mL。

關鍵詞：正交試驗法：木聚糖酶活力：優(yōu)化；測定條件

中圖分類號：Q939.97 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(20lO)04-0950-04

隨著人口的增長和資源的消耗，可再生資源的開發(fā)與利用成為國內(nèi)外學術界共同關注的焦點。木聚糖是半纖維素的主要組成成分，廣泛分布于高等植物的細胞壁中，是自然界中一種巨大的可再生生物資源。

木聚糖酶是一類能特異降解木聚糖的酶類，在造紙、食品、飼料、生物轉化等行業(yè)有廣泛的應用。酶活力是衡量酶生物活性的重要指標，在實際測定中，酶活力的結果常與所采用的各項測定條件有關，采用不同的測定條件，會得出不同的結果。當前對于木聚糖酶活力的檢測方法很多。但都沒有統(tǒng)一的標準(包括使用最為普及的DNS法)。常因應用面的不同。所采用的測定條件有所不同，導致對酶活力的最終測定結果很難進行比較。

本研究采用單因素試驗法和正交試驗法對BE-91菌株木聚糖酶活力測定的條件進行探討，以期用較少的試驗次數(shù)，獲得BE-91菌株木聚糖酶活力檢測的最佳條件，提高了試驗的效率、科學性和測定結果的準確性，為BE-91菌株分泌的木聚糖酶的相關研究提供技術基礎，期望能推進木聚糖酶制劑及其相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株及木聚糖酶產(chǎn)酶菌BE-91菌株，中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所選育并保存：木聚糖酶為在適宜條件下培養(yǎng)的產(chǎn)酶菌發(fā)酵液過0.2μzm微濾膜的濾過液。

1.1.2試劑 木糖、木聚糖購于美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器在位消毒自動控制發(fā)酵罐(瑞士比歐生物公司)，超濾裝置(德國賽多利斯公司)，冷凍離心機(美國Sigma公司)，便攜式酸度計(意大利哈納公司)，電子分析天平(瑞士梅特勒一托利多公司)，超純水器(艾柯)，移液器(美國Thermo)，分光光度計、生化培養(yǎng)箱、磁力加熱攪拌器(上海分析儀器總廠)，快速恒溫數(shù)顯水箱(天津泰斯特)，全溫振蕩器(江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司)等。

1.2方法

1.2.1 D(+)一木糖母液(10 tzmol／mL)的配制 準確稱取0.1500g木糖溶解于0.1m01／L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液中，定容至100mL，室溫保存。

1.2.2 0.8％的木聚糖底物的配制 準確稱取0.8000g木聚糖，加入80mL預熱至60％的0.1mol／L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液，磁力加熱攪拌直至溶解，室溫放置過夜，用0.1mol／L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液定容至100mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 DNS溶液的配制 準確稱取20.00g3，5-二硝基水楊酸溶解于1.5L去離子水中，加入32.0gNaOH并溶解，逐漸加入10g苯酚，10g亞硫酸鈉，600g酒石酸鉀鈉，加熱使上述試劑完全溶解，冷卻后用去離子水定容至2000mL，室溫存放在棕色瓶中。兩周后使用。

1.2.4 木糖標準曲線的繪制取6支15mm×180mm具塞試管，按表1數(shù)據(jù)分別準確移取木糖母液、0.1mol／L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液和DNS溶液，搖勻。沸水浴顯色5min，冰水浴迅速冷卻，加7mL緩沖溶液。搖勻。用分光光度計在540nm處測定標準溶液的OD值，以ODm為橫坐標，木糖濃度為縱坐標，繪制木糖標準曲線C=kxA+B(式中G為木糖濃度，k為斜率，A為吸光值，B為截距)，并計算該標準曲線的相關系數(shù)。

1.2.5酶活力測定基本方法取0.1mL稀釋50倍的木聚糖酶，加0.9mL預熱至60％的濃度為0.8％的木聚糖底物.60℃水浴準確反應5min.同時另一管裝0.1mL稀釋50倍的木聚糖酶100％滅活處理，冷卻后加0.9mL底物，作為對照。反應完成后分別向各管加入2.0mLDNS溶液，后續(xù)工作同標準曲線操作方法，測定OD₅₄₀，根據(jù)標準曲線計算得出木聚糖酶活力。每分鐘分解產(chǎn)生1 ta，moL木糖所需木聚糖酶的量定義為一個酶活力單位(U)。 1.2.6單因素試驗設計方案 設計的因素包括測定 波長、酶液稀釋倍數(shù)、酶與底物反應時間、沸水浴顯色時間等。

1.2.7正交試驗設計方案在前期試驗的基礎上，采用L₁₆(4⁵)正交試驗設計法。其中，木聚糖酶稀釋100倍、木聚糖底物濃度0.80／0、檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液0.1 mol／L、酶與底物的體積比1：9、DNS量2.0 mL、沸水浴顯色時間10 min、分光光度計測定波長540 nm為定量，選定緩沖液oH值、酶促反應溫度、酶與底物反應時間為3個因素，每個因素取4個水平，Lm(4s)正交表如表2所示，不考察各因素間的交互作用。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 波長對木糖測定的影響及標準曲線的制作按標準曲線制作方法，分別在不同波長下測定各木糖母液的OD值，結果如表3。比較表3數(shù)據(jù)可知，紫外光對木糖的最大吸收波長為540 mm，以DD₅₄₀值為橫坐標，對應的木糖濃度為縱坐標。繪制標準曲線如圖1所示。回歸方程為y=6.057 6x-0.0129相關系數(shù)R²=0.999 8。

2.1.2酶液稀釋倍數(shù)對BE-91細株木聚糖酶活力測定的影響按不同倍數(shù)稀釋酶液，其他條件同1.2.5，測定各稀釋倍數(shù)下BE-91菌株的木聚糖酶活力，結果如表4所示。由表4可知，稀釋倍數(shù)的改變。會明顯改變酶活力測定結果。在一定范圍內(nèi)稀釋倍數(shù)越大，酶活力越大，稀釋倍數(shù)越小。酶活力越低；當稀釋倍數(shù)適當時，測定結果才能準確反饋酶活力大小。由酶活力隨酶液稀釋倍數(shù)變化趨勢來看，BE-91菌株分泌的木聚糖酶測定時的適宜稀釋倍數(shù)為100倍。

2.1.3反應時間的影響木聚糖酶稀釋100倍，反應時間分別為5、10、15、20、25、30 min，其他條件同1.2.5，測定不同反應時間下BE-91菌株的木聚糖酶活力，結果如圖2所示。由圖2可以看出，反應時間在5-10 min和20-30 min之間BE-91菌株的相對酶活力變化不大，但反應時間為30min時所測木聚糖酶活力比反應時間為5 min時所測木聚糖酶活力要低約72％。這可能是因為隨著反應進行，底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加，從而加速了逆反應的進行。由此可知，BE-91菌株分泌的木聚糖酶的反應時間越短，相對酶活力越高。

2.1.4顯色時間的影響木聚糖酶稀釋100倍，酶與底物反應5 min，顯色時間分別為2、5、10、15、20min，其他條件同1.2.5，測定不同顯色時間下BE-91菌株的木聚糖酶活力。結果如圖5(注：顯色時間2、10、15、20 min對應標準曲線分別為y=7.327x-.0.019 4、y=4.857x+1.384 3、y=5.525 4x+0.987 4、y=5.863x+0.874 3)。

由圖3可以看出，顯色時間對測定結果有較大影響，顯色時間越長，酶活力測定值越大：顯色時間在10-20min時，酶活力測定值無明顯差異，但顯色時間為10min時所測酶活力值比顯色時間為2min和5 min時所測酶活力值分別高約12.64％、7.01％。由此可以推斷，BE-91菌株分泌的木聚糖酶活力測定過程中，顯色時間以10 min為宜。

2.2正交試驗分析

在單因素試驗基礎上，選定緩沖液pH值、反應溫度、酶與底物反應時間3個因素，按1.2.7設計方案分別測定各個組合條件下木聚糖酶活力，結果見表5。比較表5均值k，選出優(yōu)化水平組合為A₂，B₂，C₂，即pH值5.4，溫度62℃，反應時間3 min；但是，pH值5.4時的酶活力與pH值5.6時的酶活力基本持平，因此，BE-91菌株分泌的木聚糖酶作用pH值范圍為5.4-5.6之間。由極差R值可以看出，3種因素影響木聚糖酶活力的主次順序為C、B、A。做各因素與木聚糖酶活力關系圖，結果如圖4所示。由圖4可以看出，因素C即反應時間的影響很大，在設定的4個水平上。當反應時間為5 min時，所測得的酶活力明顯高于另外3個水平：因素B和因素C的影響相對緩和。在前3個水平下，酶活力總體呈上升趨勢，到第四個水平時，酶活力才明顯下降。

2.3 方差分析

用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對表5中數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表6。由表6可以看出，C因素(酶與底物作用時間)的F值(14.48)大于‰.(3，6)(9.78)，為顯著因素(**)；A因素(緩沖液pH值)和B因素(反應溫度)的F值均小于‰(3，6)(4.76)，在試驗選取的水平范圍內(nèi)不顯著，證明BE-91菌株分泌的木聚糖酶的作用DH值和作用溫度有較廣的適應范圍。作用pH值在5.4-5.6之間，反應溫度在62℃左右為宜。

2.4優(yōu)化前后酶活力比較

按照1.2.5酶活力測定條件和優(yōu)化后酶活力測定條件，分別測定BE-91菌株培養(yǎng)6、8和10 h時分泌的木聚糖酶活力(重復3次)，結果如表7所示。由表7可以看出，BE-91菌株培養(yǎng)6、8和10 h的發(fā)酵液酶活，在采用不同酶活力測定條件下的測定值有很大的差別。枯草芽孢桿菌BE-91菌株培養(yǎng)8 h的發(fā)酵液，在優(yōu)化后酶活力測定條件下的測定值為350.24U／mL，比優(yōu)化前的測定值提高了63.27％。3小結

BE-91菌株分泌的木聚糖酶優(yōu)化測定條件為：0.1 mL稀釋100倍的木聚糖酶與預熱至62℃的濃度為0.8％的木聚糖底物0.9 mL(用pH值5.4-5.6的0.1 mol／L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液配制).62℃水浴準確反應3 min，加入2.0 mL DNS溶液，搖勻，沸水浴顯色10 min，冰水浴迅速冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，測定540 nm波長處光吸收值，根據(jù)木糖標準曲線y=4.857x+1.384 3。計算木聚糖酶活力。在此測定條件下木聚糖酶活力達到350.24 U／mL，比優(yōu)化前的測定值提高了63.27％。

BE-91菌株分泌的木聚糖酶作用溫度高，作用pH值范圍廣，這預示著該木聚糖酶制劑在食品加工、飼料添加劑和紙漿造紙工業(yè)等方面，將具有非常廣闊的應用前景。