沙門氏菌的危害及其快速檢測方法的研究進展

摘要:沙門氏菌是一種常見的重要人獸共患病原菌，介紹了其病原學、分類、危害及原因以及目前國內外對沙門氏菌檢測方法的最新進展，主要包括:以抗體為基礎的快速檢測方法、以核酸為基礎的快速檢測方法、PCR-ELISA技術，并把它們和傳統(tǒng)檢測方法進行了比較。

關鍵詞:沙門氏菌;檢測;ELISA;PCR

中圖分類號:S854.4+3;S855.1文獻標識碼:B文章編號:1007-273X(2010)01-0010-03

隨著近年來世界范圍內的食品安全惡性事件屢屢發(fā)生，食品污染與食源性疾病構成了一個巨大且不斷擴大的世界性公共衛(wèi)生問題，直接關系到人們的身體健康和社會穩(wěn)定，并且正成為阻礙國際食品貿易發(fā)展的重要因素。由于傳統(tǒng)感染源普遍存在，新感染源不斷出現(xiàn)以及食品工業(yè)過程復雜化、人們飲食習慣的改變、人口流動性增加等因素，使感染的流行模式發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為食物中毒通常迅速大面積暴發(fā)，給人類的食品安全和健康帶來威脅，同時也給食源性疾病的控制和預防帶來新的挑戰(zhàn)[1]。在各種畜產品中，細菌性食物中毒最為常見，而由沙門氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。動物性產品中含有多種豐富的營養(yǎng)成分，非常適宜于沙門氏菌的生長繁殖，人們一旦攝入了含有大量沙門氏菌的動物性產品，就會引起細菌性感染，進而在毒素的作用下發(fā)生食物中毒。沙門氏菌不僅危害人類健康還會給畜牧業(yè)帶來巨大經濟損失。因此加強畜產品衛(wèi)生安全，防止沙門氏菌污染，不僅是發(fā)展畜牧業(yè)的需要，也是減少人類沙門氏菌食物中毒，保護人民群眾身體健康的重要措施。了解沙門氏菌的概況，有助于對其檢測，從而保證畜產品的質量，有利于畜牧業(yè)的發(fā)展和人的健康。

1病原學

沙門氏菌屬腸桿菌科，為革蘭氏染色陰性桿菌，絕大多數(shù)有鞭毛并能運動。菌體溶解時，其細胞壁所含的脂多糖釋放出來，形成內毒素[2]。已證實，一些沙門氏菌含有攜帶耐藥因子的遺傳質粒(質粒是染色體外的遺傳物質，易于從一細胞向另一細胞傳遞)。耐藥因子傳遞的對多種抗生素的耐藥性，可在敏感的細菌中散播，給治療沙門氏菌感染造成困難。

沙門氏菌廣泛存在于自然界，在溫度7～45℃的條件下均可生長，以35～37℃最為適宜，但對高熱、直接陽光照射及常用消毒藥均敏感，60℃時15min可將其殺滅[2]。

2分類

沙門氏菌的正式分類和命名始于1934年，主要有兩種分類系統(tǒng)，即尤因的分類和考夫曼―懷特的分類。按照考夫曼―懷特的分類，已確認的沙門氏菌屬有2 000多個血清型，根據(jù)沙門氏菌抗原結構的不同，可分為A、B、C、D、E……等34個組。引起人類疾病的絕大多數(shù)屬于A～E組。其中主要有豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸類沙門氏菌、雞沙門氏菌、鴨沙門氏菌等10多個血清型。沙門氏菌依據(jù)其對宿主的感染范圍可分為宿主適應血清型和非宿主適應血清型兩大類。前者除對其適應的宿主有致病性外，很少使其他宿主發(fā)病。如馬流產沙門氏菌、羊流產沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌;后者則對多種宿主有致病性，如鴨沙門氏菌、紐波特沙門氏菌、田納西沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等。

3沙門氏菌的危害

沙門氏菌不僅危害人類健康，還會給畜牧業(yè)帶來巨大經濟損失。由沙門氏菌引起的疾病主要分為兩大類:一類是傷寒和副傷寒，另一類是急性腸胃炎。如鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等污染動物性產品，進而引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌。沙門氏菌污染主要來源于患病的人和動物及其帶菌者，主要由其糞便、尿、乳汁以及流產胎兒、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和飼料等，其中飼料和水源的污染是導致沙門氏菌傳染的主要原因。畜禽感染沙門氏菌可引起相應的傳染病，如豬霍亂、雞白痢等。一般情況下畜禽腸道帶菌率比較高，當動物因患病、衰弱、營養(yǎng)不良、疲勞以致抵抗力降低時，腸道中的沙門氏菌即可經腸系膜淋巴結和組織進入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，豬霍亂沙門氏菌可引起仔豬副傷寒，急性病例出現(xiàn)敗血癥變化，死亡率相當高。慢性病例產生壞死性腸炎，影響豬的生長發(fā)育。雞白痢沙門氏菌，主要侵害雛雞，引起敗血癥，可造成大批死亡。在成年母雞則主要引起卵巢炎，可在卵黃內帶菌而傳給幼雛。沙門氏菌引起的食物中毒一般在5~10月份最易發(fā)生。人食用沙門氏菌污染的食物后，一般8~24h后發(fā)病，潛伏期最短2h，長者可達72h。主要有三種表現(xiàn)類型，即胃腸炎型、傷寒型、敗血癥型。以胃腸炎型最為常見[2]。

3.1胃腸炎型

多在食用被污染的食物8～24h后發(fā)病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹脹等，隨后出現(xiàn)腹瀉。腹瀉特點是1d為數(shù)次至20次不等，黃綠色稀水便、帶有惡臭，便中有不消化食物、黏液，偶爾有膿血。一般中等發(fā)熱，可伴有畏寒。健康的成年人，癥狀持續(xù)2～5d后可恢復，而年老體弱者則可持續(xù)較長時間。嘔吐、腹瀉嚴重者，則可發(fā)生嚴重脫水。極少數(shù)嚴重患者有呈霍亂樣暴發(fā)性胃腸炎，因劇烈嘔吐、腹瀉而脫水，電解質紊亂，很快會出現(xiàn)尿少、尿閉等等。嚴重者，特別是兒童、老年人和體弱者常因脫水、酸中毒、無尿、心力衰竭等，急救不及時而危及生命。

3.2傷寒型

多由豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等引起，出現(xiàn)類似于傷寒的表現(xiàn)。不同于傷寒的是病情較輕，病程相對短，一般為1～3周;雖腹瀉明顯，但很少并發(fā)腸出血和腸穿孔。

3.3敗血癥型

多發(fā)生于兒童或原有慢性疾病的成年人。各種沙門氏菌均可引起，但豬霍亂沙門氏菌經口進入后，早期即侵入血流，而腸道常無病變。起病通常急驟，病人有高熱、畏寒、出汗、乏力等表現(xiàn)，持續(xù)數(shù)天、1周或更長時間。部分患者可出現(xiàn)腸道外部位的局灶性感染，如關節(jié)炎、骨髓炎、腦膜炎、腎盂腎炎等。

4檢測方法概述

自19世紀后期沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原菌以來，檢測方法學都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床標本的基礎上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實質上與那些用于臨床標本的方法是相同的，此后人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，一般都要經過五個步驟:(1)前增菌;(2)選擇性增菌;(3)選擇性平板分離;(4)生化鑒定;(5)血清學鑒定。需時共約4~7d，雖然這種方法特異性較好，但費力、耗時。隨著免疫學和分子生物學技術的發(fā)展，近10~15年間發(fā)展了很多改進方法，其中許多可在48h內檢出沙門氏菌，即我們所說的“快速檢測”[3]。現(xiàn)將國內外有關的沙門氏菌快速檢測方法介紹如下。

4.1以抗體為基礎的快速檢測方法

已建立的沙門氏菌免疫學檢測方法有許多種，大致可分為酶標抗體(ELISA)、熒光抗體染色(免疫熒光法)[4]、同位素標記抗體(放射免疫)[5]為基礎的方法及其他多種以抗體為基礎，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散及免疫色譜技術的方法。但最廣泛應用的是以雙位點ELISA技術即夾心ELISA為基礎的方法。黎兆滾等人首次在國內口岸系統(tǒng)應用微量板ELISA法對進出口動物產品(魚粉、肉骨粉等)進行沙門氏菌檢測[3]。該法采用預先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經增菌處理的樣品，反應后再加入一定的指示劑，作用完畢后用酶標儀測定OD值來判定結果。此法的樣品制備過程需要24h，檢測本身需要2h(30min是操作時間，90min是孵育時間)。國外很多已商業(yè)化的試劑盒也是以免疫學為基礎的[6]。例如美國Biocontrol公司的VIP免疫擴散試劑條，即以夾心型免疫色譜反應為基礎。反應固相包括一塊用“沙門氏菌抗體—染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條。抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應區(qū)上，增菌后液體加到反應小孔內令其吸收，若樣品中存在沙門氏菌抗原，即會與偶合物作用，依次遷移到膜上，與固定在膜上反應區(qū)的抗體結合，在反應窗上呈現(xiàn)一條色帶。最后結果可在5~7min內讀取。再如澳大利亞的Tecra系列也是基于夾心ELISA基礎上的快速檢測食品中沙門氏菌的試劑盒。包括前增菌和檢測總需時間約24h。而美國的VIDAS則是基于酶聯(lián)熒光免疫分析基礎上的自動化分析系統(tǒng)。美國Biocontrol公司的I-2Test是一種快速定性檢測運動性沙門氏菌的試劑盒，14~30h即可看出免疫條帶(陽性)。自動酶標檢測儀是用酶熒光分析技術通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結合，經充分沖洗后，通過激發(fā)光源檢測，即能讀出發(fā)光的陽性標本。其優(yōu)點是檢測靈敏度高，無傳染性，檢測速度快[7]。自動酶標檢測儀靈敏度高，特異性強，可避免人為因素造成的假陰性，且能在短時間內快速篩去大量的陰性樣品。檢測時間比傳統(tǒng)方法大為縮短，但由于目前其耗材較為昂貴，在實際應用中難以大面積推廣。

4.2以核酸為基礎的快速檢測方法

生物中的核酸(DNA或RNA)是一類可以決定遺傳信息的大分子。由于所有生物都含有這種分子，可以利用它作為檢測的標靶。聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外酶促基因擴增技術，可在短時間內將靶DNA(或RNA)擴增數(shù)百萬倍[8]。PCR和DNA探針雜交聯(lián)合使用來檢測食品中沙門氏菌，具有特異性強、靈敏度高及操作簡便快速等特點[9]。探針的標記方法有放射性同位素、地高辛、生物素等。美國的Biocontrol公司的產品Probelia Salmonella[10]就是一種基于PCR擴增和DNA分子雜交技術的特異性檢測食品中沙門氏菌的自動化裝置。Gene-Trak公司也開發(fā)有檢測沙門氏菌的商業(yè)化系統(tǒng)，此法針對沙門氏菌核糖體RNA設計一段寡核苷酸探針，用于雜交檢測。美國Qualicon公司生產的BAX系統(tǒng)也是利用PCR擴增目標病原菌特異DNA片段至可檢測水平，因其他微生物沒有相同特定DNA片段，則不被擴增，故該系統(tǒng)具有很高專一性，靈敏度也很高，食品中致病菌細胞數(shù)僅為1cfu/25g時均可被檢出。1995年，美國PE公司研制出熒光PCR技術，是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針來實現(xiàn)定量定性檢測的技術。Chen等利用該技術中的TaqMan方法同步同體系擴增和檢測目標產物，實現(xiàn)熒光PCR快速檢測沙門氏菌。OPE公司也基于TaqMan原理推出沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，并被運用于食物中毒調查，由于國外的沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒的價格昂貴(每個樣品100元以上)，目前在國內很少推廣。

4.3PCR-ELISA技術

該技術是將PCR技術與ELISA相結合的一種抗原檢測技術，又稱為免疫PCR。本質是一種以PCR代替酶反應來放大顯示抗原抗體結合率的改進型ELISA。特點是利用PCR的指數(shù)級擴增效率帶來極高的敏感度。同時又具有高特異性的抗原檢測系統(tǒng)。原理是利用ELISA技術來檢測PCR擴增的產物，用生物素標記寡核苷酸探針，以鏈霉親和素包被微孔反應板，封閉后加入生物素標記的探針與之結合，標本經PCR擴增后，擴增產物與生物素標記探針進行液相雜交，然后加入HRP標記的抗地高辛抗體，加入底物(TMP)顯色，進行ELISA檢測。

鑒于我國國情，在生產中常用國標法，有條件的單位應用自動酶標檢測儀、ELISA、PCR試劑盒檢測。

參考文獻:

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