硝苯地平對鼠牙移動過程中牙周組織中MMP-1的影響

[摘要]目的:觀察在硝苯地平作用下大鼠牙齒移動過程中牙周組織中MMP-1的表達。方法:選取60只雄性SD大鼠隨機分為加力組、加力+低濃度硝苯地平組和加力+高濃度硝苯地平組，每組再按觀察時間點的不同分為5組。用免疫組化方法結合計算機光密度分析系統檢測并比較各組樣本的張力側與壓力側MMP-1的表達。結果:硝苯地平可以引起正畸牙周膜中MMP-1表達的減少，并呈藥物濃度增加而減少的更加明顯。結論:在硝苯地平影響下牙周膜張力側和壓力側MMP-1表達減少，MMP-1參與了大鼠正畸牙齒移動過程中牙周組織ECM降解與合成的調節。

[關鍵詞]金屬基質蛋白酶-1;硝苯地平;細胞外基質(ECM);鈣離子通道

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)06-0862-03

The effects of nifedipine on expression of MMP-1 on periodontal tissues in the process tooth movement of rat

ZHAI Ma-li，ZHANG Miao-miao，LIU Di，LIU He-ting，WANG Xu

(Department of Orthodontics，Stomatological School of Harbin Medical University，Harbin 150001，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of nifedipine (NIF) on expression of MMP-1 on periodontal tissue of first maxillary molar of rat during tooth movement.MethodsSixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: orthodontic group and groups that received either low or high concentration nifedipine. And each group was divided into 5 parts determined by different time points. The expression of MMP- 1 on tension side and pressure side were examined by immunehis tochemical dyeing and analyzed with photodensitometry.ResultsThe expression of MMP-1 decreased after using Nifedipine， and the decline was more obviously with higher concentration of Nifedipine.ConclusionThe expression of MMP-1 on tension side and pressure sidewere decreased. MMP-1 participates the accommodation synthesis and degradationof ECM during the tooth movement of rat.

Key words:matrix metalloproteinase-1;nifedipine;extracellular matrix;calciumion channel

正畸牙齒移動是牙周膜和牙槽骨的同時發生改建的過程，牙齒的移動除了牙槽骨的改建，還包括牙周膜的主要組成部分細胞外基質，膠原的變性，消退和重建[1]。金屬基質蛋白-1(matrix metalloproteinase 1 ，MMP-1)為間質型膠原酶，在細胞外降解過程中是必不可少的[2]。本實驗采用SD大鼠建立正畸牙齒移動模型，應用免疫組化法觀察并對比使用硝苯地平前后ECM內MMP-1的變化。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:選取60只健康雄性成年SD大鼠，體重250g左右。

1.1.2 實驗分組將60只大鼠隨機分入以下3組:加力組(組1)、加力+ 低濃度硝苯地平組(組2)、加力+ 高濃度硝苯地平組(組3)，每組20只大鼠。每組再按1、3、7、14 和21 天分為5個亞組，每組4只大鼠。

1.1.3、建立動物模型:麻醉下將一段Ni-Ti螺旋拉簧結扎于大鼠上頜第一磨牙與兩個上頜切牙間，以兩切牙為支抗向近中移動第一磨牙，力值為60g，每天加力1次，選取大鼠右側上頜為實驗側。大鼠藥物灌胃的方法:將硝苯地平片研磨后用生理鹽水配置成混懸液，濃度分別為10mg/kg、40mg/kg。每次灌胃前取大鼠稱重，按不同藥物濃度計算每只大鼠所需藥量，用灌胃針將藥液直接推注入胃。每只大鼠早晚灌胃兩次。每只大鼠雙側上頜牙齒均受藥物作用，但只有實驗側上頜牙齒既受藥物作用又受力的作用。在牙齒移動第0、1、3、5、7、10、14天，用4%多聚甲醛溶液(pH7.4) 灌注雙側頸總動脈30min，處死大鼠后，取上頜標本，保留完整左側第一磨牙及周圍牙槽骨組織，放入4 %多聚甲醛固定液中4℃固定24h，10%乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖溶液中脫鈣約28天。按常規系列乙醇脫水、制備石蠟組織切片，厚約5μm，分別行蘇木精- 伊紅染色和免疫組化染色。

1.1.4 光鏡觀察與圖像分析:分別對大鼠上頜實驗側與對照側第一磨牙的遠頰根遠中側(張力側)、中頰根近中側(壓力側)的頸1/3牙周組織中陽性信號進行觀察和計算機光密度測量，比較MMP-1表達的變化。

1.1.5 統計學分析:首先使用裂區設計進行多因素分析，其中時間因素(T)根據不同時間點分為5個水平;藥物因素(A)根據不同藥物劑量分為3個水平;部位因素(B)根據牙根的張力側與壓力側分為2個水平;加力因素(C)根據是否加力分為2個水平。其次，繪制柱狀圖描述MMP-1隨時間點的變化。

2結果

2.1 HE染色

2.1.1 各組對照側:一組的牙周膜膠原纖維排列規則，成纖維細胞分布均勻。二、三組牙周膜細胞體積增大，核濃染，胞漿豐富，呈活躍狀態。

2.1.2 一組實驗側:張力側牙周膜成纖維細胞數量較多，體積大，靠近牙根側;膠原纖維分布呈方向性(延力的方向)，牙周膜寬度在14天組表現增寬，21天組明顯;血管豐富。壓力側牙周膜成纖維細胞數量較少，體積小，靠近牙槽骨側;膠原纖維分布無方向性;血管較少，牙周膜寬度變化與張力側相反。

2.1.3 二、三組實驗側:牙周膜細胞呈長梭形靜止狀態，細胞不活躍，隨藥物濃度增加靜止狀態明顯，在14天組表現突出。

2.2免疫組化染色:圖文分析結果如下:

2.2.1對照側:正常組織中就有基質金屬蛋白酶的表達，在成纖維細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞胞漿及細胞間質中都可以看到(A:P<0.05)。

2.2.2一組實驗側:陽性信號較其對照側表達(C:P<0.05)，變化規律為:從1天組開始增加，在3天組達到高峰，然后逐漸下降直至平穩(T*C:P<0.05)。

2.2.3 二、三組實驗側:陽性信號較一組實驗側表達弱，隨藥物濃度增加減弱明顯(A*C:P<0.05)。

3討論

牙齒的移動主要依賴于牙周膜和牙槽骨的重建，為了在正畸結束保持咀嚼這一生理學功能，現在大部分的研究都集中在牙槽骨的改建過程，而牙周膜的改建過程的關注程度卻不足。

硝苯地平是用于治療心血管疾病二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑，在口腔學中關于硝苯地平的研究主要集中在牙齦增生[3]，認為硝苯地平等二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑可引起牙齦增生，Kanno 和Oliveira 等人在猴牙齦增生的動物模型上發現，硝苯地平抑制MMP-2和MMP-1的活性，而且牙齦組織中膠原含量較高[4]。硝苯地平主要能抑制鈣離子進入細胞內，硝苯地平其阻滯鈣離子內流的作用是通過與開放狀態鈣通道結合后，促使通道向失活狀態轉化，如果鈣阻滯劑與失活狀態鈣通道或靜息狀態通道結合，則阻止這種狀態向激活開放狀態轉化，隨著鈣離子在信號轉導中的作用逐漸被人們認識，硝苯地平又被應用于鈣離子通道的研究。所以本實驗旨在了解牙周膜ECM在鈣離子通道被抑制的情況下的改建過程。

在牙齒移動第三天，硝苯地平組中MMP-1的表達明顯低于加力組，其中壓力側的抑制作用更強。在其它時間段(1、7、14和21天)，MMPs表達變化無統計學意義。這些表明硝苯地平可以抑制由正畸力所引起的牙周膜細胞MMP-1高表達，而對恢復正常的MMP-1表達無影響，也就是說，硝苯地平能使正畸力所致的牙周膜重塑中MMP-1表達降低，從而抑制牙周膜重塑。圖1H表達無明顯變化，硝苯地平對靜止狀態的牙周膜成纖維細胞MMP-1表達無影響。這些發現與Bullon[5]實驗結果一致，鈣離子波動不影響牙齦組織中膠原代謝，硝苯地平對靜止的牙齦成纖維細胞鈣離子通道阻滯作用較小，對預期開放的成纖維細胞的鈣離子通道的阻滯作用大?？赡芤才c硝苯地平劑量和觀察時間有關，我們所使用的藥物劑量相對小，觀察時間相對短。

牙周膜由牙周膜成纖維細胞(HPDLF)和細胞外基質(EMC)組成。牙周膜ECM由膠原蛋白和非膠原蛋白構成，其中膠原蛋白是ECM的最主要成分。研究證明[6]:牙周膜內膠原的更新速度是最快的，它是牙齦的2倍、皮膚的4倍、骨的6倍，提示高速率的牙周膜更新是正畸牙移動的生物學基礎.MMPs的動態平衡是保證生理狀態下組織正常更新改建的關鍵，一旦平衡破壞則引發各種病理過程。MeiKle等運用免疫熒光技術研究了MMPs在慢性牙周炎組織中的分布，其結果為兩者都同時出現于組織重建活躍部位的結締組織細胞中，并且認為MMPs與牙周炎的病理過程密切相關。雖然有研究證明:[7]HPDLC表達MMP-1且在某些細胞因子作用下表達增強。但體內正畸牙齒移動過程中，牙周組織表達MMP-1的狀況如何，目前尚未見報道。本研究發現:在沒加入硝苯地平組的正常大鼠牙周膜組織中，部分牙齦成纖維細胞，牙周膜細胞胞漿中及基質內MMP-1呈弱陽性表達，證明牙周膜在生理狀態下處于不斷改建的動態平衡之中，而ECM的正常代謝是保證牙周膜健康的基礎。當牙齒施力后，這種平衡狀態被打破。1組實驗側MMP-1的改變與各文獻所述相同[8]:使用硝苯地平后，二、三組實驗側牙周膜中酶的表達隨藥物濃度的增加而不斷減少，其中壓力側的變化更加明顯。說明阻斷鈣離子通道阻礙了MMP-1的合成，細胞外降解作用減弱了，致使細胞外膠原大量堆積。

加力1天后，壓力側MMP-1陽性表達增強而張力側變化不明顯，3天后張力側與壓力側MMP-1陽性表達均增強，達到高峰，此時牙齦眼成纖維細胞、牙周膜細胞、骨細胞、血管內皮細胞以及破骨細胞胞漿與骨吸收陷窩內基質均呈強陽性表達。表明MMP-1參與了牙周膜的改建過程，影響ECM的代謝，這在以往相關研究中尚未發現報道。7天后MMP-1表達有所轉弱，但一直到2周后MMP-1表達仍呈陽性反應高于對照組，說明兩周后牙周膜仍然進行著積極的改建重塑過程。從我們的實驗結果可以看出，在加用硝苯地平后，2、3組張力側和壓力側牙周膜中酶的表達隨藥物濃度的增加而不斷減少，高濃度組中酶的表達要遠遠小于低濃度組和不加硝苯地平組。說明阻斷鈣離子通道阻礙了MMP-1的合成，細胞外降解作用減弱了，硝苯地平抑制了MMP-1的活性。

總之，本研究結果顯示在硝苯地平的影響下MMP-1參與了大鼠正畸牙齒移動過程中牙周組織ECM降解與合成的調節。

[參考文獻]

[1]Takahashi I.Expression of genes for gelatinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in periodontal tissues during orthodontic tooth movement[J].J Mol Histol，2006V37N8-9:333-342.

[2]楊楚峰，趙志河，王軍，等.正畸力作用下大鼠牙周組織中MMP-1、TIMP-Ⅱ的表達變化[J]. 口腔正畸學，2004，(S1).

[3]Kataoka M，Shimizu Y，Kunikiyo K. Nifedipine induces gingival overgrowth in rats through a reduction in collagen phagocytosis by gingival fibroblasts[J].JPeriodontol，2001，72(8):1078-1083.

[4]Kanno CM， Oliveira JA， Garcia JF，et al. Effects of cyclosporin， phenytoin， and nifedipine on the synthesis and degradation of gingival collagen in tufted capuchin monkeys (Cebus apella): histochemical and MMP-1 and -2 and collagen I gene expression analyses[J].J Periodontol，2008，79(1):114-122.

[5]Bullon P，Gallardo I，Goteri G，et al. Nifedipine and cyclosporin affect fibroblast calcium and gingiva[J].J Dent Res，2007(4):357-362，200.

[6]Ryan M，Ramamurthy N，Golub L.Matrix metalloproteinases and their Inhibition in periodontal treatment[J].Curr Opin Periodontol，1996，3:85-96.

[7]Nakaya H，Osawa G，Iwasaki N，et al.Effects of bisphosphonate on Matrix metalloproteinase enzymes in human periodontal ligament cells[J].J Periododntol，2000，71:1158-1166.

[8]張曉東，林 珠，李永明，等.大鼠牙齒移動牙周組織中Ⅰ型膠原和MMP-1和TIMP-1的表達[J].中國美容醫學，2005，14(1):12-13.

[收稿日期]2010-03-28[修回日期]2010-05-24

編輯/張惠娟