上頜骨內置式持續等張縫牽引成骨機制的實驗研究

[摘要]目的:通過對山羊顴上頜縫持續等張縫牽引成骨來延長上頜骨復合體，探討縫牽引成骨的機制。方法:在山羊兩側顴上頜縫安置自主設計制作的內置式微型自動持續等張縫牽引器，縫兩側鈦釘標記，術后定期拍攝X線片，并在4、6、8周切取牽引和未牽引的顴上頜縫及新生骨組織，進行組織學觀察。采用免疫組化染色方法研究標本中bFGF、TGF-β1、VEGF的表達和變化。結果:在牽引力的作用下，所有山羊上頜骨復合體均成功前徙。在牽引6周時出現軟骨細胞團，細胞團之間有新生骨小梁形成。間充質細胞、成骨細胞及骨細胞中bFGF、TGF-β1、VEGF均有不同程度的陽性表達或陽性表達增加，呈時間和空間上的變化。結論:經縫牽引成骨的成骨機制以膜內成骨為主，但也有軟骨成骨;bFGF、TGF-β1、VEGF以及3種膠原均參與了縫牽引成骨的成骨過程，促進了間充質細胞向成骨細胞的增殖、分化及新骨的改建。

[關鍵詞]縫牽引成骨;上頜骨復合體;軟骨成骨;膜內成骨;生長因子

[中圖分類號]Q813.1R782.2[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)06-0852-05

Experimental studies of isotension continuous sutural distraction osteogenesis mechanism on maxillary complex

LI Yan，SHI Ze-hong，YIN Ning-bei， DU Ming-juan，FANG Lin，SHI Bing-bing，ZHANG Lei，ZHAO Zhen-min

(The First Department of Plastic Surgery Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100144，China)

Abstract: ObjectiveTo study the mechanism of bone formation by observing the histology changes and bFGF、TGF-β1、VEGF expressions in zygomatico-maxillary suture and new bone tissue.MethodsUse goats as experimental animals， several self-designed internal nickel-titanium shape memory metal braces were placed on maxillary surface，by taking X-ray regularly after operation to show the exact distances that maxilla moved. Then the new bone and suture tissue were obtained in 4weeks，6weeks and 8weeks after distraction to observe the histology changes and collagen changes through microscope. The expressions ofbFGF、TGF-β1、VEGF were investigated by means of immunohistochemistry.ResultsAll goats' maxillary complex advanced successfully. Six weeks after distraction， the newborn cartilage cell group appears， and between the cartilage cell group there were forming new bone trabeculas. bFGF、TGF-β1、VEGF expressed in all groups and varies with distracting time.ConclusionsCartilaginous osteogenesis participate in bone formation in the sutural tissue. On the surface of the maxilla， main mechanism of bone formation is intramembranous osteogenesis，bFGF、TGF-β1、VEGF and all three types of collagen take part in the bone regeneration.

Key words:sutural distraction osteogenesis;maxillary complex;cartilaginous ossification;intramembranous ossification;growth factors

縫牽引成骨(Sutural distraction osteogenesis，SDO)是在截骨牽引(Distraction osteogenesis，DO)基礎上發展起來的一種微創、療效確切的矯治顱面骨骼畸形的治療方法，對顳骨研究表明[1]其縫牽引成骨機制為膜內成骨，而對于上頜骨復合體而言，其成骨方式有待進一步探討。此外既往對截骨牽引研究發現[2-4]，堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉化生長因子(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在截骨牽引的新生骨組織中均有高水平表達，但是在縫牽引新生骨組織中這些因子以及膠原纖維的表達如何，目前國內報道較少。

本研究以山羊顴上頜縫牽引成骨模型為基礎，采集骨縫及新生骨組織標本，探討縫牽引中縫及新生骨組織中的細胞及膠原的變化規律和bFGF、TGF-β1和VEGF在間充質干細胞、成骨細胞和骨細胞中表達規律，初步探討經縫牽引成骨的成骨機制。

1材料和方法

1.1 材料:3～4月齡健康成年中國山羊4只，3只牽引組1只對照組，雌雄不限，平均體重5kg(協和整形外科醫院實驗動物中心)，速眠新、蘇醒靈(北京三有獸用麻藥公司)，內置式微型自動持續等張縫牽引器，鎳鈦記憶合金材料，每個縫牽引器在壓縮至18mm時可以產生1kg力量(與北京記憶公司合作研制)，bFGF抗體、TGF-β1抗體(Santa Cuze公司)，VEGF抗體(Zeta公司)，PV6001試劑盒(美國GBI)，天狼猩紅染液、甲苯胺藍染液(本實驗室自配)，BX51倒置顯微鏡(Olympus公司)

1.2 方法

1.2.1 手術操作:牽引組動物術前禁水、禁食12h，速眠新肌注麻醉。面部去毛、碘伏消毒， 眶下緣L形切口進入， 逐層切開至上頜骨， 顯露顴上頜縫，于顴上頜縫兩側用打孔鉆打6孔，每組2孔，橫跨顴上頜縫，各組平行，間距10mm，顴上頜縫上下2孔間距離為18mm，將微型自動縫牽引器壓縮后安置于骨孔內，每側安裝3個牽引器(每側共產生3kg力量作用于與顴上頜縫)，固定后于上頜縫兩側各植入鈦釘一枚為標記，記錄鈦釘間距離，然后逐層縫合關閉切口。同法處理對側。術后1周內肌注青霉素80萬U，2次/日。常規精飼料圈養，術后7天拆線，于術后即刻、術后1周及術后3周做X線片檢查以了解顴上頜縫擴張情況(圖2)。

1.2.2標本處理:牽引組組分別于術后4周、術后6周、術后8周全麻下切取顴上頜縫及其周圍骨性組織，對照組于術后4周取材，6%多聚甲醛液4℃固定24h、0.5mol 甲酸脫鈣，修整標本，沿縫垂直向剖開，酒精逐級脫水，石蠟包埋，沿骨縫垂直向切取5μm 厚的連續切片，隨機抽取部分切片HE染色、甲苯胺藍染色、天狼猩紅染色及免疫組織化學染色。1.2.3HE染色及特殊染色:蠟塊縱向切片(5μm) ， HE染色， 普通光鏡觀察縫及新骨組織形態、結構及再生修復情況。甲苯胺藍染色，觀察骨基質及成骨細胞情況。同時縱向切片(5μm) ， 按文獻[5]方法行飽和苦味酸天狼星紅染色， 偏光顯微鏡觀察縫及新骨組織中的膠原變化。偏光顯微鏡下Ⅰ型膠原纖維緊密排列， 呈較強的雙折光性， 黃色或紅色;Ⅱ型膠原纖維顯示弱的雙折光， 呈多種彩的疏松網狀分布;Ⅲ型膠原纖維顯示弱的雙折光， 呈綠色的細纖維。觀察時需在正交下進行。

1.2.4免疫組織化學染色bFGF、TGF-β1、VEGF:石蠟縱向切片(5μm)，脫蠟至水，PBS浸泡2min×3次后高壓抗原修復，3%H2O2室溫孵育10～15min，蒸餾水沖洗PBS浸泡2min×3次，分別滴加一抗工作液:bFGF(1:150)、TGF-β1(1:250)、VEGF(1:60)，4℃過夜，PBS沖洗2min×3次，滴加適當量PV6001，室溫孵育30min，PBS沖洗2min×3次，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水透明，封片。細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為這三種生長因子的陽性信號。

2結果

2.1 大體觀察及X線片觀察見圖1、2。

2.2 組織學觀察

2.2.1 HE染色:見圖3。

2.2.2甲苯胺藍染色:見圖4

2.2.3偏振光顯微鏡觀察:見圖5。

2.3免疫組織化學染色:縫及新骨組織切片中bFGF、TGF-β1、VEGF免疫組化染色陽性信號的細胞定位與強度分級結果見表1。

bFGF在牽引過程中隨著牽引時間均有增強趨勢，間充質細胞中4周時出現陽性表達，8周開始減弱，成骨細胞中8周才開始增強，骨細胞中4周即開始增強，8周后仍未減弱，TGF-β1在間充質細胞中牽引后四周即開始強陽性表達，并一直維持到8周，成骨細胞和骨細胞中減弱為弱陽性表達，VEGF在間充質細胞和成骨細胞中牽引6周時表達為強陽性，骨細胞中VEGF在各組牽引過程中無變化，維持弱陽性表達。

3討論

縫牽引成骨通過牽張裝置對骨縫施加特定大小的機械應力，激發骨組織自身生長潛力，從而達到增加骨量的治療目的。在牽張力作用下，成骨速率可以達到兒童期骨自然生長率的4～6倍[6]。因此縫牽引被視作一種新的內源性組織工程(endogenous tissue engineering)技術。自從縫牽引成骨應用于顱面骨骼畸形矯正以來，臨床上取得了顯著的療效，而縫牽引成骨由于其微創、無風險或風險小、作用范圍廣、能使整個上頜骨復合體得到延長、顯著的矯正效果也越來越成為人們關注的熱點，為兒童唇腭裂術后繼發面中部發育不全的治療提供了一個很好的手術方法，但是其成骨機制目前仍不十分明了。

牽引成骨術的骨形成機制一直是爭議的焦點。Karp等[7]認為，狗下頜骨的牽引成骨機制主要為膜內骨化。Komuro等[8]證實，兔下頜骨新骨形成以膜內骨化和軟骨內骨化兩種方式同時進行。Sawaki等[9]研究認為，狗下頜骨牽引骨形成的主要形式為膜內骨化，部分區域可見纖維性軟骨島。骨發育過程中，軟骨細胞、骨細胞和成骨細胞是三種主要細胞，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量分別反映了軟骨細胞和成骨細胞的成熟狀況。膠原纖維，不僅起支架作用還影響著細胞的增殖與分化、骨質的形成與吸收以及骨基質礦化等， 機體通過膠原的合成分解和改建使骨修復得以完成和完善。本實驗發現，上頜骨縫牽引過程中，三種膠原都存在，其含量隨著牽引時間的延長而變化，6周時在HE切片上可以清楚地發現縫組織有軟骨細胞團形成，其間有新生骨小梁，Ⅰ型膠原增多，Ⅱ型膠原逐漸減少;在甲苯胺藍染色的切片上，牽引8周時，在骨膜下可以見到新骨形成，因此從本實驗中可以推測，縫牽引中存在兩種成骨方式:軟骨成骨和膜內成骨，以膜內成骨為主，其中軟骨成骨參與了骨縫組織的新骨的形成，而在骨膜下，均為膜內成骨，并且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原均參與了骨的形成和改建。

盡管縫牽引的成骨方式和骨改建過程與骨折修復有顯著不同，但同樣涉及一系列生長因子和細胞因子乃至激素的網絡調節，其中骨生長因子在牽張后新骨再生中的作用可能非常重要。bFGF是一種廣譜的有絲分裂原，主要由間充質細胞和成骨細胞合成，對來源于中胚層和神經外胚層的細胞具有明顯的促進增殖作用，并促進新生血管形成，加速軟組織、軟骨、骨組織及神經組織損傷的修復。此外，它不僅能刺激成骨樣細胞表達TGF-β1，而且能誘導微血管生成，與其他骨和血管生成因子協同調控成骨活動。Tavakoli等[10]用牽張成骨術延長綿羊下頜骨后20天，發現bFGF呈穩定高水平表達。Okazaki[11]等通過注入外源性bFGF于兔脛骨牽張間隙內，發現bFGF有促進新骨生成的效應。TGF-β1廣泛存在于正常組織細胞和轉化細胞中，在體內能夠誘導間葉細胞、成骨細胞、成軟骨細胞及破骨細胞的增殖與分化，加速血管的生成，增加Ⅰ型膠原的合成，是骨吸收和骨形成之間有力的調節和偶聯因子，并可抑制新破骨細胞的形成。TGF-β1可以直接刺激成纖維細胞外基質的合成，并對新形成的基質降解有顯著的抑制作用，可刺激成骨細胞分泌幾種骨基質蛋白，如纖維結合蛋白、蛋白聚糖和骨粘連素等[12-13]。此外它對其他激素及生長因子有調控作用，其中對VEGF有促進和抑制雙向調節作用[14-15]。VEGF通過與血管內皮細胞上的受體結合，具有強大、特異性促血管內皮細胞增生和血管生成作用。其他因子的促血管生成作用全部或部分通過VEGF的作用得以實現。Spector等[16]發現VEGF對體外培養的成骨細胞無增殖的作用，但能引起成骨細胞遷移分化。Tsurumi等[17]將培養的人成骨細胞加入一定量的VEGF發現，成骨細胞對1，25-二羥維生素D3(1，25(OH)2D3)的合成作用明顯增強。由于1，25(OH)2D3是鈣合成所必需的，因此VEGF可能參與了成骨及骨塑形過程。金增強等[18]對犬進行面中縫牽引發現，骨縫中出現大量新生血管，受張力影響的上頜骨周圍骨縫出現適應性重建。血管生成可以為骨再生提供充足的營養物質和代謝廢物運輸，為局部骨再生及代謝提供有利的微環境。

本研究中發現對照組中，除在間充質細胞中bFGF表達陰性外，其他因子在三種細胞中均有陽性或弱陽性表達，分析可能與我們所采用的動物年齡較小，正處于快速生長期有關。實驗組山羊顴上頜縫及縫周新生骨組織中，除VEGF在骨細胞中表達不明顯外，三種因子在三種細胞中均有程度不同的表達，且隨著牽引時間變化而變化，牽引后4周在間充質細胞中bFGF出現陽性表達，TGF-β1同時出現陽性表達增強，VEGF陽性表達稍滯后于bFGF和TGF-β1，6周后表達增強，分析可能在持續等張的牽引力的作用下，縫組織中間充質細胞分泌bFGF增加，促進了間充質細胞的增殖與分化，同時bFGF水平的增高也促進了TGF-β1的分泌，共同誘導成纖維細胞、成骨細胞、成軟骨細胞的增殖與分化，在TGF-β1的誘導下，VEGF的分泌增加，發揮特異性促血管內皮細胞增生和血管生成作用，為局部骨再生、改建及代謝提供了有利的微環境。同時在VEGF的作用下，1，25(OH)2D3的合成作用明顯增強，局部鈣攝取增加，為新生骨的改建提供了物質基礎。在成骨細胞中bFGF于8周后陽性表達才開始增強，VEGF在6周即開始陽性表達，均滯后于間充質細胞，在骨細胞中，bFGF 4周開始強陽性表達，TGF-β1和VEGF陽性表達無增強或減弱，在我們的實驗中發現，牽引8周后，TGF-β1及bFGF在間充質細胞和骨細胞中仍維持高水平的表達，陽性表達維持時間較截骨牽引長，且高水平表達出現時間也較截骨牽引晚，分析可能由于縫牽引沒有截骨，對縫作用比較溫和有關，其次由于采取了持續、等張的牽引力進行牽引，在持續、等張的力的刺激下，由于力的持續作用，導致了分泌細胞持續分泌TGF-β1及bFGF等骨形成因子，維持細胞中這些因子的高表達，促進骨再生與重建。其強陽性表達何時出現下降還需要進一步加以研究。

綜上，通過本實驗可證實，在縫牽引過程中，機械牽引力轉變為生物分子信號，使骨縫組織細胞分泌bFGF、TGF-β1、VEGF等細胞因子，在細胞因子網絡的調控下，骨縫間充質干細胞增殖、并向成骨細胞、成軟骨細胞分化，通過膜內成骨、軟骨內成骨這兩種成骨方式形成新生骨組織。在成骨的過程中，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三種類型的膠原均參與了成骨及改建過程，并隨著牽引過程不斷進行，其含量發生動態變化。

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[收稿日期]2010-03-07 [修回日期]2010-04-25

編輯/張惠娟