負重訓練和補肽對衰老大鼠骨骼肌α-actin mRNA和MHC異形體mRNA表達影響的研究

劉豐彬，王洪丹，賈 華

負重訓練和補肽對衰老大鼠骨骼肌α-actin mRNA和MHC異形體mRNA表達影響的研究

劉豐彬1，王洪丹2，賈 華2

目的：探討負重訓練和補充大豆多肽對D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌α-actin mRNA和MHC異形體mRNA表達的影響。方法：56只3月齡雄性SD大鼠隨機分為7組、每組8只、成年組、模型組、小負重組、大負重組、補肽組、補肽小負重組、補肽大負重組。除成年組外，其余各組進行6周D-半乳糖造模同時施加相應大、小負重的跑臺訓練和補肽干預，6周后處死大鼠，測試各項指標。結(jié)果：與成年組相比，模型組大鼠骨骼肌α-actin、MHC-I、MHC-IIa、MHC-IIx mRNA表達量顯著下降（P＜0.01），MHC-IIb mRNA的表達量顯著升高（P＜0.01），負重訓練或補肽干預均可以有效緩解這種骨骼肌衰老性的表現(xiàn)，兩種方法具有顯著的交互作用（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論：負重訓練或補充大豆多肽均可以有效緩解衰老大鼠骨骼肌α-actin和MHC異形體mRNA表達量的衰老性表現(xiàn)，并且兩種方法聯(lián)合應用效果好于單一干預因素。

負重訓練；大豆多肽；骨骼肌；α-肌動蛋白；肌球蛋白重鏈異形體

衰老是一個十分復雜的多環(huán)節(jié)生物學過程，由于衰老而引發(fā)的醫(yī)療、社會保障、老年人生活等一系列社會和經(jīng)濟問題，也使世界各國對老年人的健康問題引起了普遍關注[1－3]。面對人體最先開始衰老的組織之一，骨骼肌衰老的研究已經(jīng)逐漸引起各國學者特別是體育科研人員的重視[4－5]。研究骨骼肌衰老的真正原因和作用機制，并通過合理有效的方法或措施來干預骨骼肌的衰老，延緩因此而引發(fā)的一系列人體退行性的變化，值得深入研究。

本研究運用醫(yī)學衰老研究中常用的D－半乳糖皮下注射的方法，建立大鼠亞急性骨骼肌衰老模型，并選取負重訓練和補充大豆多肽兩種方式在模型形成過程中進行干預，通過測試各組α－actin mRNA和MHC異形體mRNA的變化，分析兩種方式干預骨骼肌衰老的作用效果，并初步探討其干預骨骼肌衰老過早出現(xiàn)可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

3月齡SD純系雄性健康大鼠56只，平均體重300 g，清潔級，由河北省動物實驗中心提供（許可證編號：SCXK（冀）2003－1－003）。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠 3～4 只，室溫（22±2）℃，相對濕度55%左右，每天自然光照，自由飲水攝食。動物飼料選用國家標準嚙齒類動物混合飼料，由河北省動物實驗中心提供。大鼠購回后隨機分 7組：成年組（C）、模型組（M）、小負重組（S）、大負重組（B）、補肽組（P）、補肽小負重組（PS）和補肽大負重組（PB），每組8只。

1.2 動物模型建立及各組動物具體處理

除成年組常規(guī)飼養(yǎng)6周外，其余各組進行大鼠亞急性骨骼肌衰老模型的復制[6]，D－半乳糖溶液按200 mg/（kg·d）（5%）進行頸背部皮下注射，每天一次，連續(xù)6周。跑臺負重跑訓練方案參考 Bedford 等[7]和閆萬軍等[8]的方法，跑速 15 m/min，坡度 0°，跑2 min，休息2 min為一組，每天連續(xù)6組，每天一次，周日休息，共6周。大、小負重分別相當于大鼠最大負重70%和30%。大豆多肽主要含五肽、六肽和八肽，分子量在200～600 Da之間，經(jīng)質(zhì)譜法測定多肽的氨基酸序列為：（1）Leu Ala Pro Glu（2）Met Ser Leu Pro Thr Asn（3）Arg Leu Met Leu His Leu Ala Pro，由山東中食都慶生物技術有限公司提供。各補肽組在每次運動后30 min內(nèi)進行灌胃，每日一次，連續(xù)6周，大豆多肽灌胃劑量按0．15 g/100 g（15%）進行，運動對照組灌胃等量生理鹽水[9]。

1.3 動物取材及樣本處理

實驗6周末，最后一次運動后所有組大鼠禁食12 h進行取材。腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉處死，無菌條件下取大鼠左側(cè)股四頭肌股直肌深層肌肉約200 mg，－70℃冰箱保存，待測骨骼肌分子生物學指標。

1.4 測試指標及方法

以內(nèi)對照半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）方法分析骨骼肌肌動蛋白（α－actin）mRNA和肌球蛋白重鏈（MHC）異形體mRNA表達。相應試劑由美國Promega公司提供。

1.4.1 細胞總RNA的提取 采用Trizol法提取細胞總RNA。

1.4.2 cDNA合成 逆轉(zhuǎn)錄反應體系20 μL，包括細胞總RNA 2 μL，隨機引物（500 ng/μL）1 μL，5×buffer緩沖液 4 μL，10 mM dNTP 1 μL，RNasin （50 u/μL）1 μl，M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（300 u/μL）1 μL，去離子水 10 μL。

1.4.3 RT-PCR擴增 引物序列檢索自NCBI－Nucleotide數(shù)據(jù)庫，采用Primer5．0軟件設計，由大連寶生物工程有限公司合成。α－actin（115bp） 上下游引物：5'－ TGCCTGCTATGTATGTGGC TATTCA －3'和 5'－ CTCATAGATGGGCACGTTGTGG－3'，MHC－I（537bp）上下游引物：5'－ GCCAACTATGCTGGAGCTGAT －3'和5'－CCATTCTGGAAAGTACACCTCGG－3'，MHC－IIa（488bp）上下游 引 物 ：5'－ ATGCTAACTGACCGGGAGAATC －3'和 5'－AT CAATGCTGGCCACACTGAT－3'，MHC－IIb（382bp）上下游引物：5'－ TGTACCAGAAGTCCGGGTTGAAG －3'和 5'－GGGATAG CACTTGCATTGAGAACT －3'，MHC－IIx（463bp）上下游引物：5'－CTAAAGGCAGACTCTCCCACTG －3'和 5'－ CACCTCTGCAT TATACACTGGC －3'，β －actin （500 bp） 上 下 游 引 物 ：5'－CAGGGTGTGATGGTGGG －3'和 5'－GGAAGAGGATGCGGCAG －3'。反應體系25 μL，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，各檢測指標上下游引物（10 pmol/μL）2 μl，β－actin 上下游引物（10 pmol/μL）1 μL，Red Taq DNA 聚合酶擴增體系（1U/μL）12．5 μL，雙蒸水 9．5 μL。α－actin、MHC－I、MHCIIa 、MHCIIb、MHCIIx、β－actin 均先采用95℃預變性5 min，95℃變性30 s，分別在57℃、4個53℃和56℃退火30 s，72℃延伸5 min，進行35個循環(huán)。

產(chǎn)物分析：取15 μL擴增產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳（100 V，30 min），應用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，讀取各條產(chǎn)物帶的光密度值并分析照相。目的基因條帶光密度參數(shù)與內(nèi)參基因（β－actin）條帶光密度參數(shù)的比值作為目的基因mRNA的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，用SPSS for Windows 13統(tǒng)計軟件進行分析。針對單一因素多組間數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）；各因素對指標的主效應以及各因素間交互作用對指標的影響，采用雙因素方差分析。顯著性水平為 P＜0．05，非常顯著性水平為 P＜0．01。

2 結(jié) 果

2.1 骨骼肌組織α-actin mRNA表達的比較

與C組相比，M組大鼠骨骼肌中α－actin mRNA表達顯著下降（P＜0．01）。雙因素方差分析，負重訓練或補肽均能使衰老大鼠骨骼肌中 α－actin mRNA 表達顯著升高（P＜0．01），負重聯(lián)合補肽可使 α－actin mRNA 表達進一步升高（P＜0．01），兩者具有顯著的交互作用（見表1）。

表1 骨骼肌組織α-actin mRNA表達的比較（n=8）Table 1 Comparisons of α-actin mRNA expression of skeletal muscle（n=8）

2.2 骨骼肌組織MHC-I mRNA表達的比較

與C組相比，M組大鼠骨骼肌中MHC－I mRNA表達顯著下降（P＜0．01）。雙因素方差分析，負重訓練或補肽均能使衰老大鼠骨骼肌中 MHC－I mRNA 表達顯著升高（P＜0．01），負重聯(lián)合補肽可使 MHC－I mRNA 表達進一步升高（P＜0．01），兩者具有顯著的交互作用（見表2）。

表2 骨骼肌組織MHC-I mRNA表達的比較（n=8）Table 2 Comparisons of MHC-I mRNA expression of skeletal muscle（n=8）

2.3 骨骼肌組織MHC-IIa mRNA表達比較

與C組相比，M組大鼠骨骼肌中MHC－IIa mRNA表達顯著下降（P＜0．01）。雙因素方差分析，負重訓練或補肽均能使衰老大鼠骨骼肌中 MHC－IIa mRNA 表達顯著升高（P＜0．01），負重聯(lián)合補肽可使 MHC－IIa mRNA 表達進一步升高（P＜0．01），兩者具有顯著的交互作用（見表3）。

表3 骨骼肌組織MHC-IIa mRNA表達的比較（n=8）Table 3 Comparisons of MHC-IIa mRNA expression of skeletal muscle（n=8）

2.4 骨骼肌組織MHC-IIb mRNA表達的比較

與C組相比，M組大鼠骨骼肌中MHC－IIb mRNA表達顯著升高（P＜0．01）。雙因素方差分析，負重訓練或補肽均能使衰老大鼠骨骼肌中 MHC－IIb mRNA 表達顯著降低（P＜0．05），負重聯(lián)合補肽可使 MHC－IIb mRNA 表達進一步降低（P＜0．01），兩者具有顯著的交互作用（見表4）。

表4 骨骼肌組織MHC-IIb mRNA表達的比較（n=8）Table 4 Comparisons of MHC-IIb mRNA expression of skeletal muscle（n=8）

2.5 骨骼肌組織MHC-IIxmRNA表達的比較

與C組相比，M組大鼠骨骼肌組織中MHC－IIx mRNA表達顯著下降（P＜0．01）。雙因素方差分析，負重訓練或補肽均能使衰老大鼠骨骼肌中 MHC－IIx mRNA 表達顯著升高（P＜0．01），負重聯(lián)合補肽可使 MHC－IIx mRNA 表達進一步升高（P＜0．01），兩者具有顯著的交互作用（見表5）。

表5 骨骼肌組織MHC-IIx mRNA表達的比較（n=8）Table 5 Comparisons of MHC-IIx mRNA mRNA expression of skeletal muscle（n=8）

3 討論與分析

關于衰老和抗衰老的研究歷來都是國際性的醫(yī)學難題，國內(nèi)外學者也在嘗試各種方法和手段來對抗衰老，研究領域也涉及多個層面[9－12]。如何將運動和營養(yǎng)干預這兩種更為經(jīng)濟和安全的方式結(jié)合起來，使身體各器管、各系統(tǒng)的功能產(chǎn)生良好的效應，以對抗機體衰老，特別是骨骼肌的衰老，值得深入研究和探討。

借鑒以往的研究成果和相關動物實驗的經(jīng)驗[8，13－14]，本研究采用在大鼠背部負重物的方式模擬人類的抗阻訓練，并確定了本實驗的動物負重訓練方案。同時參考有關動物營養(yǎng)實驗的結(jié)果和實驗方法[15－17]，本研究采用經(jīng)大鼠口腔灌胃補充大豆多肽的營養(yǎng)干預方法。

研究表明，骨骼肌α－actin是肌動蛋白亞類的一種，其基因表達與骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能關系密切[18－19]。隨著年齡的增長，下丘腦－垂體－性腺及其相應神經(jīng)控制系統(tǒng)的活動減弱，使骨骼肌αactin基因的表達降低[20]。本研究也證實了這種觀點，與C組相比，M組大鼠骨骼肌α－actin mRNA的表達顯著降低。提示：D－半乳糖造成衰老大鼠神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力減退，下丘腦－垂體－性腺活動減弱，進而影響到基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，使骨骼肌α－actin的合成速率減慢，α－actin mRNA表達量下降。

而6周的負重訓練可以使衰老大鼠骨骼肌α－actin mRNA表達量顯著性的提高。提示：負重訓練對可能會使骨骼肌產(chǎn)生一種慢性的微損傷，骨骼肌代償性調(diào)動各種途徑加強收縮蛋白的合成，使骨骼肌處于不斷的運動刺激與蛋白質(zhì)的不斷降解和修復的狀態(tài)，導致α－actin mRNA表達量的升高。6周大豆多肽的補充也可以顯著提高衰老大鼠骨骼肌α－actin mRNA表達量，但作用效果不及負重訓練。提示：大豆多肽可以糾正衰老導致的mRNA合成和分解代謝的不平衡，提高mRNA在體內(nèi)含量和活性，從轉(zhuǎn)錄水平上影響α－actin基因的表達，同時其也可能影響α－actin的合成速率，從翻譯水平上影響α－actin的合成，但具體機制還有待于進一步的研究。

同時，本研究還發(fā)現(xiàn)負重聯(lián)合補肽比單獨運用其中一種方法更能夠提高D－半乳糖衰老大鼠骨骼肌α－actin mRNA的表達量。

肌球蛋白重鏈異形體（MHC）是肌纖維收縮特性的主要決定因素。研究表明，MHC合成的速率隨年齡的增加而有所下降，這種下降可能和MHC mRNA表達的減少有關[21－22]。本研究得到了相似的結(jié)果，與C組相比，M組大鼠骨骼肌MHC－I、MHC－IIa、MHC－IIx mRNA的表達顯著降低，但MHC－IIb mRNA表達顯著升高。提示：隨著大鼠衰老程度的加深，出現(xiàn)了骨骼肌機能下降以及肌肉萎縮的現(xiàn)象，可能是由于支配肌纖維的運動神經(jīng)元出現(xiàn)了萎縮和退化，并在MHC轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用，影響了mRNA的合成。至于MHC－IIb mRNA表達的結(jié)果似乎與先前的研究有所不同，也可能是衰老導致骨骼肌MHC異形體的構(gòu)成比例發(fā)生變化，即從 MHC－IIa、MHC－IIx 向 MHC－IIb的轉(zhuǎn)變，但具體的原因還需進一步研究。

大量的研究證實，體育鍛煉，特別是規(guī)律的力量訓練可以延緩因增齡而引起的骨骼肌機能的下降，并且在基因水平上也有所表現(xiàn)[4，23]。本研究結(jié)果顯示：與M組相比，各負重組大鼠骨骼肌 MHC－I、MHC－IIa、MHC－IIx mRNA 的表達顯著提高，MHCIIb mRNA表達顯著降低，這與以往的研究基本一致[21]。提示：6周的負重訓練，增加了對衰老骨骼肌的神經(jīng)－肌肉刺激，對MHC各種亞型mRNA的合成產(chǎn)生積極的作用，導致與骨骼肌功能密切的 MHC 構(gòu)成比例發(fā)生變化，即從 MHC－IIb，MHC－IIx，MHCIIa向MHC－I轉(zhuǎn)變。但有研究認為，力量訓練使MHC－I和MHCII之間的相互轉(zhuǎn)化比較復雜和困難，而MHC－II各亞型之間的轉(zhuǎn)化則較為容易和常見[19]，其中涉及負重訓練可能導致骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活、運動單位的重組和ATP酶活性調(diào)節(jié)等原因有待深入的研究。

關于營養(yǎng)補充對MHC異形體mRNA表達的影響，也有不少的報道，但缺少對衰老骨骼肌MHC異形體mRNA表達的研究[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與M組相比，P組大鼠骨骼肌MHC-I、MHCIIa、MHC-IIx mRNA的表達顯著提高，MHC-IIb mRNA表達顯著降低，但效果不及負重組明顯。提示：在衰老的過程中補充大豆多肽，可以有效的改善體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝，并可能增加ATP酶和MHC相關調(diào)節(jié)因子的活性，提高MHC含量和合成速率，在轉(zhuǎn)錄、翻譯或者翻譯后等多個水平上影響MHC mRNA的表達，但大豆多肽影響MHC mRNA表達的確切原因還不十分清楚。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)負重聯(lián)合補充大豆多肽比單獨運用其中一種方法更能夠改善大鼠骨骼肌MHC mRNA的衰老性表現(xiàn)，但由于影響MHC蛋白水平和mRNA表達水平的因素較多，真正弄清其中的調(diào)控機制，有待進一步的深入研究。

4 結(jié) 論

（1）6周D-半乳糖皮下注射，可以使大鼠骨骼肌出現(xiàn)αactin、MHC-I、MHC-IIa、MHC-IIx mRNA 表達量下降和 MHCIIb mRNA的表達量提高等衰老性表現(xiàn)。（2）在造模的同時進行6周的負重訓練或補充大豆多肽干預，可以有效緩解骨骼肌αactin和MHC異形體mRNA表達量的衰老性表現(xiàn)。（3）負重訓練聯(lián)合補充大豆多肽干預大鼠骨骼肌α-actin和MHC異形體mRNA表達量的衰老性表現(xiàn)的效果好于單一干預因素。

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Effect of Weight Training and Soy Polypeptide Supplement on α-actin mRNA and MHC Isoforms mRNA of Aging Rat Skeletal Muscle

LIU Fengbin1，WANG Hongdan2，JIA Hua3
（1．School of PE，Dalian University，Dalian 116622，China；2．Dept．of Graduate，Jilin Institute of Physical Education，Changchun 130022，China；3．School of PE，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050016，China）

Objective：To study of the effect of weight training and soy polypeptide supplement on α－actin mRNA and MHC isoforms mRNA of D－galactose of aging rat skeletal muscle．Method：56 3－month male SD rats were randomly divided into 7 groups，8 in each group：adult group，model group，small load exercise group，big load exercise group，peptide group，peptide and small load exercise group，peptide and big load exercise group．All the groups were modeled in 6－week D－galactose injection and interfered in the corresponding big and small weight run training and soy polypeptide supplement except adult group．The rats were killed after 6 weeks，and tested the indicators．Result：Compared with the adult group，the α－actin，MHC－I，MHC－IIa，MHC－IIx mRNA expression in rats skeletal muscle of model group were significantly decreased （P＜0．01），MHC－IIb mRNA expression was significantly increased（P＜0．01），weight training or soy polypeptide supplement could effectively alleviate the aging performance of skeletal muscle，they had notable interaction（P＜0．01 or P＜0．05）．Conclusions：Weight training or soy polypeptide supplement may alleviate the age－related performance of aging rats skeletal muscle in α－actin and MHC isoform mRNA expression effectively，the combined effect of two methods was better than a single intervention factor．

weight training；soy polypeptide；skeletal muscle；α－actin；myosin heavy chain isoforms

G 804．23

A

1005-0000（2010）05-0388-04

2010-06-21；

2010-08-02；錄用日期：2010-08-05

河北省自然基金（項目編號：C2008000177）；大連大學博士科研基金聯(lián)合資助項目

劉豐彬（1981-），男，遼寧大連人，講師，博士，研究方向為體育健康促進的理論與應用。

1.大連大學體育學院，遼寧大連116622；2.吉林體育學院研究生部，吉林長春130022；3.河北師范大學體育學院，河北石家莊050016。