生姜透皮貼對運動病大鼠腦組織中三種酶活性的影響

康照昌 李玉榮 敖明章 (湖北職業技術學院護理學院,湖北 孝感 432000)

隨著現代航天航海事業的發展,世界各國都在開展運動病的研究工作,對防治運動病的研究已經取得了一定的成果,但尚無公認的療效確切、副作用少的治療措施。尋找更為有效、更安全的抗運動病方法日益引起國內外重視。目前的抗運動病藥物主要包括抗膽堿、抗組胺類及擬交感胺類等,雖有一定的抗運動病作用,但多有中樞抑制作用,限制了其臨床使用。而我國自古就應用中草藥生姜抗眩暈病,生姜有確切的抗運動病防止暈車、暈船的作用〔1〕。美國科學家也證明生姜確有防暈船等效果〔2〕,且相對其他防暈船藥物相比,無口干,昏睡,血壓降低等副作用。近年來,國內學者進行的動物實驗證實,生姜的有效成分有明顯的止吐抗運動病的作用〔3〕,且無明顯副作用。南通醫學院航海醫學研究所與南通市中醫院聯合研究的生姜合劑由生姜、半夏等 6味中藥組成〔4〕,及單獨的生姜粉等用于防治運動病,效果較暈海寧強,副作用不明顯,因而生姜成為各國學者普遍看好的新的抗運動病藥物。本實驗運用乙醇法提取生姜有效成分,將其與透皮劑氮酮混合制成帖劑貼在運動病大鼠的臍部〔5〕,測定大鼠大腦皮質、小腦皮質、腦干前庭區腦細胞中 Na+-K+-ATP酶、堿性磷酸酶 (ALP)、細胞色素氧化酶 (CCO)活性變化〔6〕,透皮療法使藥效發揮更加持久,而且方法簡便,作用迅速〔7〕,為抗運動病新型藥物的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性 SD大鼠 40只、體重 (200±10)g,購自湖北省實驗動物中心,動物合格證號：SYXK(鄂)2003-0007,檢疫后備用。單籠飼養,自由攝食水,飼養 1 w后開始實驗。隨機分 5組,分別是正常組、模型組和生姜高、中、低劑量組,每組 8只。模型組和生姜組大鼠臍部脫毛,每天將透皮貼貼在臍部,給藥 30 min。隨后給予 2 h的運動病刺激：將大鼠無束縛地放入旋轉裝置中的有機玻璃籠內,先順時針方向加速度從16°/S2加速至 120°/S2,然后立即以 45°/S2減速至 0,馬上逆時針再以 16°/S2加速至 120°/S2,然后以 45°/S2減速至 0,如此反復。旋轉時間為 2 h〔8〕,除正常組不接受旋轉刺激外,其他各組處理相同,旋轉刺激完成后動物放回飼養籠中。連續刺激 3 d,1次 /d。每天觀察動物接受刺激后的反應情況,第 3天刺激結束后取動物迅速斷頭處死,冰上迅速分離腦組織,取出大鼠三部位腦組織,放入液氮,轉入 -80℃冰箱備用。

1.2 藥品與材料 生姜透皮貼：生姜 (華中科技大學鑒定)清洗去雜切碎,雙蒸水浸泡,閃式提取器提取,過濾,濾液減壓濃縮至浸膏狀,按 50、100和 200 mg/kg將生姜浸膏與氮酮混勻,制成 3 cm×4 cm生姜透皮貼,另用氮酮制作空白貼劑供模型組使用。ALP試劑盒 (批號：060101)、Na+-K+-ATP酶試劑盒(批號：060101)、CCO試劑盒 (批號：060101)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器 低溫高速離心機 (Backman)、電熱恒溫水溫箱 (上海醫療器械七廠)、721分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司)。

1.4 酶細胞化學反應 將組織用含 2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸鈉緩沖液固定液 (pH1.4 0.1 mol/L)4℃固定1 h。二甲砷酸鈉緩沖液漂洗后,與液氮冷凍后兩組樣品并列放在一起,恒冷箱冷凍切片為 10μm,分別測定進行 Na+-K+-ATP酶、ALP和 CCO〔9〕。用 1%鋨酸固定 1 h,EPON812包埋,LKB超薄片機切片,不進行電子染色,直接在 H ITACH I-H300型電鏡下觀察。

1.5 酶活性定量分析 采用 XY-540型彩色圖像分析系統定量分析〔10〕,128×128像素點,每張切片隨機測 5次,酶切片反應至少測 30次,以陽性反應面積 (單位為μm2)作為酶反應強度的參數,取其平均值。

2 結 果

2.1 一般情況 大鼠受到運動病刺激后,自發活動明顯減少,皮毛蓬松聳立,排尿排便增多。運動病刺激結束后大鼠行為表現有所恢復,約 3 h后開始活動或進食。與正常組比較,生姜組和模型組大鼠消瘦,進食量未見明顯改變。

2.2 各組大鼠大腦皮質三種酶活性 運動病大鼠大腦皮質Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應面積明顯減小,ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠大腦皮質中Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應面積明顯增大,ALP陽性反應面積減小,見表1。

表1 大鼠大腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

表1 大鼠大腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

與正常組比較：1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較：3)P＜0.05,4)P ＜0.01,下表同

組別 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常組 90.324±23.302 100.483±71.119 59.817±14.909模型組 37.531±17.1522) 50.737±33.9712) 125.639±85.3321)生姜低劑量組 60.308±3.390 80.694±41.572 68.535±12.109生姜中劑量組 61.255±19.2794) 81.699±51.5744) 66.219±43.1063)生姜高劑量組 59.557±21.321 80.991±22.191 68.569±31.925

2.3 各組大鼠腦干前庭區三種酶活性 運動病大鼠腦干前庭區中Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應面積明顯減小,ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠腦干前庭區中 ALP、Na+-K+-ATP酶、細胞色素氧化酶陽性反應面積明顯增大,ALP陽性反應面積減小,見表2。

表2 大鼠腦干前庭區三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=)

表2 大鼠腦干前庭區三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=)

組別 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常組 70.686±15.341 151.649±10.249 98.633±49.102模型組 40.464±17.9912) 52.526±22.3472) 258.361±112.0091)生姜低劑量組 59.819±26.337 93.389±55.001 156.221±19.991生姜中劑量組 61.229±23.3694) 96.991±71.0264) 160.669±79.9123)生姜高劑量組 58.321±19.029 94.258±38.034 156.631±87.567

2.4 各組大鼠小腦皮質三種酶活性 運動病大鼠小腦皮質中Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應面積明顯減小,ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠小腦皮質區中 ALP、Na+-K+-ATP酶、CCO陽性反應面積明顯增大,ALP陽性反應面積減小 ,見表3。

表3 大鼠小腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

表3 大鼠小腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(±s,n=8)

組別 Na+-K+-ATP酶 CCO ALP正常組 118.629±79.930 141.594±96.021 50.378±11.102模型組 0.534±12.2362) 62.632±51.0192) 82.826±15.9811)生姜低劑量組 81.265±19.556 93.559±47.108 63.676±17.438生姜中劑量組 85.335±31.4414) 95.173±33.1154) 66.779±26.1133)生姜高劑量組 80.081±55.147 94.250±19.902 62.551±36.775

3 討 論

大腦和小腦皮質及腦干前庭區等中樞對運動病的發病有關〔11〕。ALP和 Na+-K+-ATP酶反應產物主要定位于以上三部位毛細血管內皮細胞膜上,也呈陽性反應。CCO反應產物主要定位于以上三部位腦細胞線粒體膜上。

旋轉刺激可引起神經細胞膜 Na+-K+-ATP酶活性下降,ALP活性上升,線粒體 CCO活性下降。這可能表明旋轉刺激引起 Na+-K+泵效率明顯下降,導致細胞膜外 K+濃度上升,高濃度 K+可打開神經細胞膜上電壓依賴性 Ca2+通道,導致 Ca2+內流。神經細胞膜外高 K+和細胞內高 Na+濃度梯度是引起Ca2+內流和神經細胞興奮性降低的一個重要因素,ALP活性上升可能與膜的通透性增加有關,同 Ca2+內流亦相關。CCO活性降低同有氧代謝水平降低有關,這可能是腦血流量減少的一個重要因素〔12〕。

何麗婭〔13～15〕等在家兔急性完全腦缺血再灌注模型上觀察生姜的腦復蘇效應,顯示生姜提取液能抑制腦組織脂質過氧化產物MDA的生成,提高腦組織中 SOD活性和 Na+-K+-ATP酶活性,能有效地保護缺血再灌注大腦的過氧化氫酶活性,同時改善缺血組織代謝和缺氧狀況,明顯改善細胞膜上 Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-ATP酶活性。

本實驗應用組織化學定位方法和圖像定量分析方法,研究表明,旋轉刺激可引起大腦和小腦皮質及腦干前庭區神經細胞Na+-K+-ATP酶活性下降,ALP活性上升,線粒體 CCO活性下降。用生姜透皮貼后,運動病大鼠三種腦組織ALP活性顯著減低、Na+-K+-ATP酶及 CCO活性明顯升高。

綜上所述,生姜提取物制成透皮貼可能通過改善腦血流分布,調整細胞內 CCO、ALP、Na+-K+-AT酶和 ALP等一系列酶活性,增強腦細胞的興奮性,從而保持中樞神經系統興奮性,起到抗運動病的作用。

盡管近年來對運動病發病機制有了較多較深入的認識,但要清晰地闡明運動病發生的神經通路仍有待深入的研究。隨著航空航天事業的發展,運動病的預防和治療已成為神經科學、軍事醫學及臨床醫學的重要研究課題之一〔16〕。目前對于生姜的有效成分的提取,化學成分分析,藥理作用研究和臨床應用等方面,均取得了較大進展。本實驗使用生姜提取物制成的透皮貼,它具有吸收快、藥效持久釋放、作用效果好且無副作用等特點,為運動病的防治提供了很好的思路,為研制新型抗運動病藥物提供實驗依據,下一階段將使用生姜透皮貼運用于預防和治療運動病人的實驗研究,將為運動病人帶來福音。

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