土壤甲苯、乙苯和二甲苯對蚯蚓及小麥的毒性效應

劉 堯,周啟星,2*,謝秀杰,林大松,榮偉英 (.南開大學環境科學與工程學院,環境污染過程與基準教育部重點實驗室/天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,天津 30007；2.中國科學院沈陽應用生態研究所,中國科學院陸地生態過程重點實驗室,遼寧 沈陽 006)

苯、甲苯、乙苯和二甲苯統稱 BTEX,屬于單環芳香類化合物,易揮發且可溶于水,是原油和石油產品的重要組份,也是一種重要的化工原料.甲苯、乙苯和二甲苯因化工廢水排放、污水灌溉或儲油罐、輸油管的泄露而進入土壤并進一步污染地下水,其對生態環境及人體健康造成嚴重影響,已引起了人們的廣泛重視,并被很多國家列為環境優先污染物[1-3].

近年來,國內外對 BTEX的研究主要集中于人體健康危害性[4]、環境行為[5-6]、降解機理[7]等方面.對BTEX污染環境的修復工作更是目前的研究熱點[2,8-10].但關于BTEX對陸生生態系統的生態毒性及其機理的研究較少[11-13],目前國內還沒有其對土壤生態系統的急性毒性數據.蚯蚓是評價土壤生態安全性的重要指示生物,其中赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)已被廣泛應用于土壤環境污染物的毒性效應研究[14-16].小麥(Triticum aestivum L.)具有易培養、生長周期短的優點,常常被作為模式生物應用于多種污染物的陸生生態毒性研究.種子發芽和根伸長的急性毒性試驗可對污染物的危害和生態風險進行診斷及評價[17-19].本實驗以赤子愛勝蚓和小麥為研究對象,以甲苯、乙苯和二甲苯(三者簡稱TEX)為目標化合物,研究其對陸生生物的毒性效應,為這 3種化合物的土壤環境標準的制定提供基礎數據和科學依據.

1 材料與方法

1.1 土壤

供試土壤為潮土,采自天津郊區農田,為0～20cm土層樣品,土壤樣品自然風干,過2mm篩備用.供試土壤理化性質見表1.

表1 供試土壤理化性質Table 1 pHysiochemical properties of the tested soil

1.2 受試生物與試劑

試驗生物赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)購于天津賈立明蚯蚓養殖廠.在實驗室(20±2)℃、通風良好的暗處培養,以牛糞為食物定期喂食.實驗前選取體重在 300～500mg、生殖環帶明顯、體態相似的健康成蚓為實驗個體.小麥(Triticum aestivum L.)購于當地市場,經 H2O2浸泡消毒后使用.試驗開始前進行的種子發芽率實驗表明發芽率＞95%.

試劑:甲苯、乙苯和二甲苯均為分析純,購于天津市津東天正精細化學試劑廠.

1.3 污染物溶液配制

甲苯、乙苯和二甲苯不易溶于水,采用助溶劑無水乙醇及乳化劑吐溫 80配制污染物溶液,無水乙醇及吐溫 80的摩爾分數應不超過0.2%[20-22].移取所需溶劑于具塞玻璃瓶中,依次移入一定量的無水乙醇及吐溫80,再移入一定量的蒸餾水配制至所需濃度,混勻后使用.

1.4 蚯蚓毒性試驗

蚯蚓急性毒性實驗按照An[23]建議的密封土壤微宇宙方法進行.使用內徑 2.6cm、高8cm的有底玻璃管為實驗容器,針對TEX為揮發性污染物的特點,改良了OECD.207方法.根據預實驗中蚯蚓不死及完全死亡的濃度,在二者之間設置正式試驗濃度,其中甲苯試驗濃度設為300,400,500,600,700mg/kg;乙苯設為150,200,250,300,400mg/kg;二甲苯設為125,150,175,200,250mg/kg.并設置溶劑對照組.稱取10g干土樣品于玻璃管中,快速且均勻滴入污染物溶液,調整水土比為1:4,迅速用鋁箔紙封口.并用封口膜將鋁箔紙粘緊在玻璃管壁上,防止污染物揮發.待平衡24h后,快速將土拌勻,每個玻璃管放入1條已清腸24h的蚯蚓,再次封口,將其置于(20±1)℃、濕度為75±1%的生化培養箱中避光培養.每處理重復 10次,分別于24h、48h記錄蚯蚓死亡數及中毒癥狀,蚯蚓對針刺無反應判為死亡.

1.5 小麥種子發芽試驗

根據預實驗中小麥芽長和根長抑制率10%～60%的濃度,設置正式試驗濃度,其中甲苯濃度設為250,500,1000,1500,2000mg/kg;乙苯設為100,200,300,400,500mg/kg;二甲苯設為50,100,200,300,400mg/kg.實驗周期為50h,每處理重復3次,并設置溶劑對照組.稱取50g干土樣品于9cm玻璃培養皿中,快速且均勻加入污染物溶液,使水土比為1:5,迅速用鋁箔紙封口,并用封口膜將鋁箔紙粘緊在皿壁上,防止污染物揮發.平衡4h后將15粒小麥種子播種于土壤中,再次封口,置于生化培養箱中(25±2)℃黑暗培養.當小麥對照種子初生根達到2～3cm時,終止試驗,取出發芽種子,測量根長和芽長.其中,根長是指根和芽接點處到最長根尖的長度;芽長是根基點到芽尖的長度.而且僅當根長和芽長均超過3mm 時,才認為是發芽成功[17].根據對照土壤中種子根和芽伸長值計算添加污染物的土壤中小麥根和芽伸長抑制率.

1.6 數據處理

所有試驗數據采用SPSS 13.0和Excel進行處理.小麥毒性試驗數據使用平均數±標準誤差表示.使用單樣本 K-S test檢驗數據正態分布性質.蚯蚓半數致死濃度LC50及小麥芽、根半數抑制濃度IC50采用單位概率回歸分析法得出.

2 結果與分析

2.1 對赤子愛勝蚓的生態毒性

在整個實驗過程中,對照組均未出現蚯蚓死亡及不適現象.甲苯、乙苯及二甲苯暴露的中毒癥狀顯示為:低濃度暴露(甲苯濃度＜500mg/kg;乙苯濃度＜250mg/kg;二甲苯濃度＜175mg/kg),蚯蚓身體僵硬,蠕動遲緩,反應遲鈍;高濃度暴露(甲苯濃度≥500mg/kg;乙苯濃度≥250mg/kg;二甲苯濃度≥175mg/kg),蚯蚓喪失向土壤深層挖掘的能力,在土壤表層劇烈掙扎,分泌體液,出血、身體斷裂甚至死亡.蚯蚓的死亡率隨著污染物濃度的升高及暴露時間的延長而增加(圖1).

由表2可知,3種污染物暴露情況下,經單樣本 K-S檢驗,蚯蚓的死亡率均屬于正態分布(P＞0.05),可以使用單位概率回歸分析法進行進一步分析.由圖1a可見,當甲苯濃度為300mg/kg時,暴露于土壤中的蚯蚓在24h內無死亡現象,隨著暴露時間延長至 48h,蚯蚓不但通過體表接觸毒物,還可通過進食土壤與毒物接觸,蚯蚓死亡率增至10%.當甲苯濃度為600mg/kg時,24h內蚯蚓死亡率為50%,48h內蚯蚓死亡率驟增至90%,這可能是由于污染物對蚯蚓體表和消化系統的2種毒性作用在一定濃度下達到極限,產生了躍遷式毒性效應[24].蚯蚓暴露于甲苯濃度為700mg/kg的土壤中48h,死亡率為100%.甲苯對蚯蚓的毒性具有明顯的劑量-效應相關關系,24h及48h的Pearson相關系數r分別為0.988及0.979.通過單位概率回歸分析法計算得到甲苯對蚯蚓的24h及48h半數致死濃度LC50分別為583.6,454.3mg/kg (表2).

圖1 甲苯、乙苯、二甲苯對蚯蚓的毒性效應曲線Fig.1 Curves for toxic effects of toluene, ethylbenzene and xylene on the earthworm Eisenia fetida

由圖1b可見,當乙苯濃度為150mg/kg時,暴露于污染土壤中的蚯蚓在 24h內無死亡現象,暴露時間延長至48h,蚯蚓死亡率增至 40%.污染物濃度提高至 400mg/kg,蚯蚓 24h死亡率為60%,48h死亡率為100%.乙苯對蚯蚓的毒性也具有較明顯的劑量-效應相關關系,24h及 48h的Pearson相關系數r分別為0.980及0.926.通過單位概率回歸分析法計算得乙苯對蚯蚓的24h及48h半數致死濃度LC50分別為346.8,167.1mg/kg(表2).

表2 甲苯、乙苯和二甲苯對蚯蚓的毒性效應分析Table2 Toxic effects of toulene, ethylbenzene and xylene on the earthworm Eisenia fetida

由圖1c可見,當二甲苯濃度為125mg/kg時,暴露于污染土壤中的蚯蚓在 24h內的死亡率為10%,暴露時間延長至48h,蚯蚓死亡率增至50%.污染物濃度提高至250mg/kg,蚯蚓24h死亡率為70%,48h死亡率為100%.二甲苯對蚯蚓的毒性同樣存在明顯的劑量-效應相關關系,24h及48h的Pearson相關系數r分別為0.969及0.959.通過單位概率回歸分析法計算得到二甲苯對蚯蚓的24h及 48h半數致死濃度 LC50分別為192.4,127.2mg/kg (表2).

因為實驗周期較短(48h),可認為污染物主要是通過皮膚接觸而對蚯蚓產生毒性,口腔接觸產生的毒性是次要的.參考前蘇聯制定的化學物質急性毒性分級標準[25](表3),可初步判定本實驗中甲苯暴露 24h對蚯蚓屬中等毒性,暴露時間延長至 48h則屬高毒性;乙苯及二甲苯兩個時間段暴露對蚯蚓均屬高毒性.

表3 化學物質急性毒性分級標準[25]Table 3 The grading criteria for acute toxicity of chemicals[25]

2.2 對小麥幼苗的生態毒性

由圖2可見,小麥的芽、根抑制率隨著土壤中污染物濃度的增高而變大.3種污染物暴露情況下,經單樣本K-S檢驗,小麥的芽、根抑制率均屬于正態分布(P＞0.05),可以使用單位概率回歸分析法進行進一步分析.甲苯對小麥的芽、根生長具有明顯的劑量-效應相關關系,Pearson相關系數 r分別為0.950,0.962.通過單位概率回歸分析法計算得甲苯對小麥芽、根半數抑制濃度IC50分別為1449.6,978.6mg/kg;乙苯對小麥的芽、根生長具有明顯的劑量-效應相關關系,Pearson相關系數 r分別為0.972,0.979.通過單位概率回歸分析法計算得乙苯對小麥芽、根半數抑制濃度IC50分別為482.4,343.8mg/kg;二甲苯對小麥的芽、根生長具有明顯的劑量-效應相關關系,Pearson相關系數r分別為0.986,0.969.通過單位概率回歸分析法計算得二甲苯對小麥芽、根半數抑制濃度IC50分別為435.5,197.2mg/kg (見表4).由于當土壤中污染物濃度達到IC50時,植物已受到了嚴重的影響,一般使用 IC10表示植物受污染物影響的毒性閾值[26],甲苯、乙苯和二甲苯對小麥芽的IC10分別為342.2,195.4,45.9mg/kg,對小麥根的IC10分別為206.7,134.5,26.3mg/kg.甲苯、乙苯和二甲苯污染條件下,小麥種子根長抑制率與芽長抑制率均在0.01水平顯著相關,Pearson相關系數r分別為0.993、0.991和0.988.

圖2 甲苯、乙苯和二甲苯對小麥的芽、根伸長抑制率的影響Fig.2 Effects of toulene, ethylbenzene and xylene on inhibition rate of wheat shoot and root elongation

3 討論

對于土壤中的揮發性有機化合物來說,研究其急性毒性效應比其慢性毒性效應更有意義[28],因此在本實驗中設置蚯蚓急性毒性實驗周期為24h和48h,小麥種子根伸長和芽伸長抑制實驗周期為50h.

一般認為,污染物的水溶性越大,其在土壤環境中的生物可利用性越強[27].甲苯、乙苯和二甲苯(總)在水中的溶解度分別為:515,152和160～220mg/L[28].由表2和表4可知,這3種物質對蚯蚓及小麥的急性毒性大小順序均為二甲苯(總)＞乙苯＞甲苯,二甲苯與乙苯的急性毒性相差不大,甲苯的毒性最小,這與范亞維等[21-22]在研究BTEX對水生生物毒性影響效應時觀察到的結果相似.這可能是由3種苯系物辛醇-水分配系數(Kow)不同而引起的.甲苯、乙苯和二甲苯均屬于非極性麻醉性化合物,非極性麻醉化合物的毒性體現在其對細胞膜的穿透作用上[29],污染物的Kow越大,就越容易非選擇性通過細胞膜進入生物體內而體現毒性.甲苯、乙苯和二甲苯(總)的lgKow分別為:2.69,3.13,3.15～3.20[28],導致二甲苯對土壤生物顯現出最大的毒性,其次是乙苯,甲苯雖然有較大的水溶性,但是lgKow是3種物質中最小的,導致顯現出的毒性也最小.說明有機污染物的生態毒性不僅與其在水中的溶解度有關,還與其他物理化學性質及其對靶標生物的毒性機制有關[17].

由表4可知,3種污染物對小麥芽、根生長抑制具有明顯的劑量-效應相關關系(Pearson相關系數r均在0.01水平顯著相關),說明小麥芽長、根長可用于指示土壤被甲苯、乙苯及二甲苯污染的程度,但3種污染物對根的IC10均小于對芽的IC10,說明小麥種子根長對污染物脅迫的響應較芽長更為敏感,這也與Liu等[30]的研究結論相符,在種子的發芽過程中,相對于芽來說,根與污染土壤的接觸更加直接.另外由于芽生長需要根從土壤中攝取養分維持,小麥芽長的抑制與根長的抑制有密切關系[30],這也在本實驗中得到了驗證(2種參數在0.01水平上顯著相關).

4 結論

4.1 甲苯、乙苯和二甲苯對蚯蚓的毒性影響具有明顯的劑量-效應關系,且隨著暴露時間的延長,蚯蚓死亡率增加.參考前蘇聯制定的化學物質急性毒性分級標準,可初步判定本實驗中甲苯暴露 24h對蚯蚓屬中等毒性,暴露時間延長至 48h則屬高毒性,乙苯及二甲苯兩個時間段暴露對蚯蚓均屬高毒性.

表4 甲苯、乙苯和二甲苯對小麥的毒性效應分析Table 4 Toxic effects of toulene, ethylbenzene and xylene on wheat Triticum aestivum L.

4.2 甲苯、乙苯和二甲苯對小麥芽、根生長抑制具有明顯的劑量-效應關系,小麥芽長、根長均可用于指示土壤被甲苯、乙苯及二甲苯污染的程度,但小麥種子根長對污染物脅迫較芽長更為敏感,根長抑制率與芽長抑制率之間有明顯的相關關系.

4.3 甲苯、乙苯和二甲苯對蚯蚓及小麥的急性毒性大小順序均為二甲苯(總)＞乙苯＞甲苯.

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