ICAM-1在大鼠STZ糖尿病性白內障中表達的實驗研究

王曉輝 徐國興 潘永明

ICAM-1在大鼠STZ糖尿病性白內障中表達的實驗研究

王曉輝1徐國興1潘永明2

1.福建醫科大學附屬第一醫院眼科 2.河南省洛陽醫院眼科

目的：觀察糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞轉化生長因子β-1（TGF-β1）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和Ⅰ-膠原 （COL-Ⅰ）的表達，用以研究ICAM-1在糖性白內障發病機制中的作用。方法：120只SD大鼠隨機分為兩組，在糖尿病組中，一次性腹腔注射STZ建立糖尿病模型；用免疫組化SP法分別于2、4、8周末觀察糖尿病性白內障晶狀體上皮細胞中ICAM-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表達變化及其相關性。結果：在糖性白內障組晶狀體上皮細胞中ICAM-1、 TGF-β1和COL-Ⅰ的表達明顯增高，與對照組比較差異有統計學意義,且TGF-β1與ICAM-1和 COL-Ⅰ之間的表達表現出明顯的正相關關系。結論：在糖性白內障組晶狀體上皮細胞中ICAM-1的表達明顯增高，TGF-β1可以促進晶狀體上皮細胞ICAM-1和COL-Ⅰ的表達，ICAM-1通過介導細胞與細胞間、細胞與細胞外基質粘附，促進HLEC的粘附、增生和移行，從而在糖性白內障中發揮重要作用。

細胞間粘附分子-1 糖尿病性白內障 晶狀體上皮細胞 轉化生長因子β-1 Ⅰ-膠原

糖尿病性白內障常見的病理變化是在晶狀體前囊膜下和后囊膜下發生混濁[1]。當晶狀體發生前、后囊膜下型白內障時，晶狀體上皮細胞形成斑片樣多層生長并出現類似梭狀的形態特點，甚至呈成纖維細胞樣改變，同時在前囊膜下型白內障的混濁斑塊中存在Ⅰ型膠原和粘蛋白的表達[2]。以往研究表明，TGF-β1也能引起晶狀體上皮細胞發生斑片樣多層生長并出現類似梭狀的形態特點[3],但其作用機制尚不明確。粘附分子是一類介導細胞間或細胞與細胞外基質間粘附作用的膜表面糖蛋白，Nishi等[4]發現術后即取的和培養的晶體上皮細胞都表達ICAM-1。因此我們推測，在糖性白內障的發生過程中，TGF-β1在誘導晶狀體上皮細胞表達Ⅰ型膠原的同時，也誘導ICAM-1的表達增強，通過ICAM-1介導細胞與細胞間、細胞與細胞外基質間的粘附，誘導細胞發生斑片樣多層生長，導致白內障的形成。我們通過建立鏈脲佐菌素大鼠糖尿病性白內障模型，檢測晶狀體上皮細胞（LECs）中ICAM-1、TGF-β1及COL-I的表達的變化規律，研究ICAM-1在糖尿病性白內障發生、發展中的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物。SD大鼠（福建醫科大學實驗動物中心，許可證號：2002-0006）。

1.2 實驗試劑

鏈脲佐菌素（Sigma 公司），小鼠抗大鼠ICAM-1抗體、兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠COL-Ⅰ抗體（武漢博士德公司），SP免疫組化超敏試劑盒（福州邁新生物公司）。

1.3 主要儀器

OLMPUS 數碼相機（C3040-ABU）、OLMPUS 光學顯微鏡（BH-2）、one touchⅡ血糖測定儀、電子分析天平（FA1104）、石蠟切片機(LKB-Nova 5型) 。

2 實驗方法

2.1 建立糖尿病動物模型。大鼠禁食12h后，一次性腹腔注射劑量為70mg/kg的2%STZ溶液（用pH4.5，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液臨時配置），三天后采大鼠尾靜脈血測血糖濃度，血糖濃度在16.7mmol/L以下的則不能視為糖尿病的大鼠。正常組僅給予腹腔注射pH4.5，0.1mol/L的檸檬酸緩沖液。

2.2 檢測指標和方法。從腹腔注射STZ開始，用裂隙燈檢察晶狀體變化（每周1次）并監測血糖（每兩周一次）。分別于實驗開始后2周末、4周末及8周末，白內障組和正常組大鼠各取20只（40只眼），測血糖，稱重，取眼球。取出的眼球立即用10%中性福爾馬林液固定，制成0.4μm厚的石蠟切片。

2.3 免疫組織化學染色SP法檢測ICAM-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表達,免疫組化實驗步驟按Ultra Sensitive SP超敏試劑盒免疫組化染色步驟進行。

2.4 數據分析及統計學處理

ICAM-1主要表達于細胞膜上，陽性反應為棕黃色顆粒。TGF-β1和COL-Ⅰ主要表達于細胞漿，陽性反應為棕黃色顆粒。在光鏡下隨機選擇觀察50個晶狀體上皮細胞，用陽性細胞數占細胞總數的百分比來表示陽性表達率。采用兩因素的方差分析、直線相關分析，以P＜0.05作為差別有顯著意義的檢驗標準，所有統計均在SPSS11.0軟件上運行。

3 結果

3.1 血糖測定結果。白內障組大鼠血糖在STZ注射后第3天起至第8周末均保持較高的水平；而正常組大鼠的血糖值一直保持在正常值范圍（詳見表1）：

表1 血糖測定結果（mmol/L,）

3.2 裂隙燈下大鼠晶狀體變化情況。正常組大鼠晶狀體始終保持透明；而白內障組大鼠在第2周末在晶狀體可見空泡出現，第4周末可見晶狀體周邊部出現白色絮狀混濁，到第8周末混濁程度增加，混濁范圍擴大。

3.3 TGF-β1的表達。正常組大鼠晶狀體上皮細胞中可見到少數TGF-β1蛋白表達；白內障組的晶狀體上皮細胞中可見TGF-β1明顯表達。兩組間的差異有顯著性（t2周末=13.826，t4周末=35.012，t8周末=48.523，各組間均P<0.05）；在三個時間組中，白內障組的TGF-β1表達逐漸增多（F=503.25,P<0.05；SNK法兩兩比較各組間均P<0.05）；而正常組的TGF-β1表達無明顯變化（F=0.266,P=0.650）(圖1)。

圖1 TGF-β1在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表達

3.4 ICAM-1蛋白的表達。正常組晶狀體上皮細胞中未見到ICAM-1表達；白內障組中晶狀體上皮細胞膜可見棕黃色顆粒，表明ICAM-1表達明顯。兩組間的差異均有顯著性（t2周末=27.214，t4周末=60.542，t8周末=70.259，各組間P<0.01）；在三個時間組中，白內障組的ICAM-1表達逐漸增多（F=98.235, P<0.01；SNK法兩兩比較各組間P<0.05）；而正常組的無明顯變化（F=0.254,P>0.05）(圖2)。

圖2 ICAM-1在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表達

3.5 COL-Ⅰ的表達。正常組晶狀體上皮中未見到COL-Ⅰ的表達；白內障組的晶狀體上皮細胞漿內可見多數COL-Ⅰ棕黃色顆粒。兩組間的差異有顯著性（t2周末=48.56，t4周末=40.84，t8周末=30.54，各組間均P<0.05）；在三個時間組中，白內障組的細胞陽性率逐漸增高（F=385.234,P<0.05；SNK法兩兩比較各組間均P<0.05）；而正常組的細胞COL-Ⅰ陽性率率無明顯變化（F=1.235,P=0.401）(圖3)。

圖3 COL-Ⅰ在STZ-糖尿病大鼠LECs中的表達

3.6 兩組LECs中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表達情況比較（表2）及相關分析。經直線相關分析，在白內障發展過程中，TGF-β1與ICAM-1和COL-Ⅰ的表達變化呈正相關(r=0.623，P<0.05/(r=0.663，P<0.05) (圖4，圖5)。

表2 正常組與白內障組的LECs中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表達情況（%,x±s ）

圖4 TGF-β1與ICAM-1的表達關系散點圖

圖5 TGF-β1與COL-Ⅰ的表達關系散點

4 討論

在正常情況下，晶狀體上皮細胞為單層細胞，排列極為規則[1]。當晶狀體上皮細胞的這種正常的結構和排列發生改變時，晶狀體就可能發生混濁而導致白內障的形成。研究表明，晶狀體上皮細胞可緩慢增殖、移行，并在一定條件下轉化為纖維細胞從而促進纖維化的形成。糖尿病性白內障最常見的病理改變為晶狀體前、后囊膜下混濁[1]。近年來研究發現，當晶狀體發生前、后囊膜下型白內障時，晶狀體上皮細胞形成斑片樣多層生長并出現類似梭狀的形態特點，甚至呈成纖維細胞樣改變，同時在前囊膜下型白內障的混濁斑塊中存在Ⅰ型膠原和粘蛋白的表達[2]。本實驗表明，STZ造成Ⅰ型糖尿病的高血糖狀態并最終引起晶體混濁而形成白內障。在光鏡下，正常對照組晶狀體上皮細胞呈單層排列，較為規律。而在糖性白內障組中，晶狀體上皮細胞發生了斑片樣聚集生長、形成復層結構的病理特征，并似梭形細胞至成纖維細胞樣，與前囊膜下白內障和后囊膜混濁的病理特征相似。

近年來研究表明，TGF-β也可誘導晶狀體上皮細胞產生斑片樣多層生長并出現類似梭狀的形態特點，甚至呈成纖維細胞樣改變的病理變化，并在白內障發生過程中起重要作用。研究發現，TGF-β可引起大鼠晶體上皮細胞伸長、異常排列和增殖、胞外基質堆積增厚，囊膜皺縮[3]。而在本實驗中，我們發現正常大鼠的晶狀體存在TGF-β1低水平的表達，而糖性白內障組中存在明顯的表達，證實了TGF-β1在糖性白內障發病機制中的重要作用；TGF-β1隨著病程的發展進行性表達增強，反應TGF-β1對于晶狀體上皮發生斑片樣狀增生和梭形變化起著重要作用，符合糖性白內障發展的病理生理過程。

細胞外基質( extra cellular matrix,ECM)是機體內多種器官組織生存的細胞外骨架。細胞外基質由細胞合成分泌而來，它們對于內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等具有趨化作用，促進細胞在基質上的粘附，進而使細胞快速增殖。Nishi等有報道[4]，體外培養的白內障患者晶狀體上皮細胞可以合成分泌Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ各型膠原。國內張曉紅等[5]的結果表明，部分白內障患者晶狀體囊中有Ⅰ型膠原的存在，可能來自其下面的晶狀體上皮細胞。在本實驗中，我們發現在正常晶狀體上皮中不表達Ⅰ型膠原，而在糖性白內障組中出現Ⅰ型膠原的明顯表達，且隨著病程的發展進行性表達增強，表明Ⅰ型膠原在糖性白內障發病機制中的重要作用，Ⅰ型膠原是一種纖維性膠原，作為晶狀體上皮細胞的細胞外骨架，它在細胞的移行、增殖、化生以及組織的疤痕化中起重要作用，因而可導致晶狀體上皮發生斑片狀多層聚集和梭形變化，白內障形成。

粘附分子是一類介導細胞間或細胞與細胞外基質間粘附作用的膜表面糖蛋白，它們在胚胎的發育分化、正常組織結構的維持、炎癥與免疫應答、刨傷修復、腫瘤轉移等多種生理病理過程中具有重要作用。晶狀體上皮細胞能表達多種細胞粘附分子，如整聯蛋白( integrin)、ICAM- 1、CD44等.通過這些細胞粘附分子，晶狀體上皮細胞得以粘附在其下方的囊膜上，細胞粘附分子可能參與白內障術后晶狀體上皮細胞移行至后囊膜過程中的細胞脫落與粘附[6]。ICAM-1是Rothlein等于1986年研究淋巴細胞黏附時發現的[7]，克隆號CD54，屬免疫球蛋白超家族成員，是分子量為80～110KD的單鏈糖蛋白[8,9]，具有5個細胞外串聯的單鏈免疫球蛋白樣結構域和1個胞質尾樣結構域。在體內ICAM-1有二種存在形式，一種為膜型，是一種細胞表面跨膜蛋白抗原。另一種是可溶型(sICAM-1)，它被認為是在一些因素作用下，由膜型ICAM-1從細胞表面脫落而形成，包括有膜型ICAM-1胞外區的D1D2D4D5的全部或大部分片段，存在于血循環中。Nishi等[6]用免疫組化染色測定人晶體上皮細胞的粘附分子的表達，白內障摘除術中做環形前囊膜切除后，將獲取的前囊晶體上皮細胞進行培養2周，結果發現術后即取的和培養的晶體上皮細胞都表達ICAM-1、β1-整合素、CD44。當在細胞培養液中加入ICAM-1、β1-整合素、CD44的單克隆抗體（10mg/mL）后，晶體上皮細胞在前囊膜的膠原和層粘連蛋白基質上的增殖和移位受到明顯的抑制。從該研究可以看出發生白內障的人晶體上皮細胞ICAM-1的表達增加。近年有研究表明，晶體上皮細胞和細胞外基質間的相互作用的改變和異常可引起細胞轉化和基因表達異常，從而導致晶狀體前、后囊膜下纖維化[10]。我們在實驗中發現，ICAM-1在正常組晶狀體上皮細胞中不表達，而糖性白內障組晶狀體上皮細胞中ICAM-1存在明顯的表達，且隨著白內障病程的發展，ICAM-1的表達呈進行性增加。結合Nishi等的研究，我們可以推測ICAM-1不僅可以促進晶體上皮細胞在細胞外基質上生長和移行，而且促進了晶體上皮細胞與細胞外基質的粘附作用。因此推測ICAM-1是通過促進晶體上皮細胞的增殖、移行及改變晶體上皮細胞與細胞外基質的粘附狀態的機制在白內障發生中發揮重要的作用。

在實驗中，我們發現隨著白內障的發生、發展過程的推移，晶狀體混濁程度不斷加深，晶體上皮細胞中TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ表達明顯增加，各時間段間的差異有顯著性；而且TGF-β1、ICAM-1和COL-Ⅰ的表達變化具有高度正相關。由此表明TGF-β1在糖尿病性白內障的發生過程中有一定調節作用，并且可以增加晶狀體上皮細胞表達細胞外基質成分COL-Ⅰ和ICAM-1，推測TGF-β1誘導的細胞與ECM之間的相互作用是通過調節晶體上皮細胞中ICAM-1的轉錄活性而發揮作用的。ICAM-1的過量表達可由TGF-β1所誘導，并通過促進晶體上皮細胞與細胞外基質成分的粘附，改變晶體上皮細胞與細胞外基質的粘附狀態，從而在晶狀體上皮細胞發生移行、轉分化和增殖中發揮起始作用，促進糖尿病性白內障的發生發展。

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福建省衛生廳青年科研基金資助項目（課題編號：2005-2-37）。