纈沙坦對兔視網膜色素上皮細胞的影響

楊 娟 徐國興

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纈沙坦對兔視網膜色素上皮細胞的影響

楊 娟 徐國興

福建醫科大學附屬第一醫院眼科中心

目的：通過研究纈沙坦對兔視網膜色素上皮細胞生長的影響，以期尋找藥物治療、延緩PVR的發生、發展。方法：體外培養兔視網膜色素上皮細胞，取第三代細胞加入96孔板，分為①正常對照組；②血小板源性生長因子（PDGF）刺激組： 50μg/L PDGF；③纈沙坦（Valsartan）治療組：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。分別行MTT法檢測兔RPE細胞增殖能力，ELASA法檢測兔RPE細胞培養液TGF-β1含量。結果：PDGF刺激組兔RPE細胞的增殖速度加快，而Valsartan治療組對PDGF刺激后的兔RPE生長有明顯抑制作用，且明顯抑制PDGF刺激兔RPE細胞分泌TGF-β1。結論：Valsartan可抑制體外培養的兔RPE細胞生長。

纈沙坦 視網膜色素上皮細胞 抑制生長

增殖性玻璃體視網膜病變（proliferative vitreoretinopathy, PVR）是玻璃體視網膜手術后產生的一種視網膜玻璃體纖維組織增生性病變，是導致玻璃體視網膜手術失敗的最常見原因，故抑制、延緩PVR的產生是提高玻璃體視網膜手術成功率的關鍵[1]。纈沙坦（valsartan）是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，實驗研究顯示血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能有效減輕組織纖維化程度，從而抑制肝臟、腎臟、心臟、胰腺等臟器的纖維化[2]。已有研究證實視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）細胞在PVR中起主導作用[3]，本實驗通過研究Valsartan對RPE細胞生長的影響，旨在證實Valsartan能否抑制RPE生長而在PVR中起類似的抗纖維化作用，以期尋找藥物治療、延緩PVR的發生、發展。

1 材料和方法

1.1 材料

美國Forma CO2培養箱、蘇州超凈工作臺、日本OLYMPUS倒置相差顯微鏡、美國Metertech公司Σ550型酶聯免疫檢測儀、太倉HZ-8211K恒溫振蕩儀、北京精利LCZ-5-2型低溫自動平衡離心機。DMEM／F12培養基、胎牛血清、小牛血清（均為Gibco公司）、TGF-β1測定ELASA試劑盒（南京建成生物工程研究所）

1.2 兔RPE細胞體外培養與鑒定

參照本科室建立的方法[4]。

1.3 MTT法檢測兔RPE細胞增殖能力

將第3代兔RPE細胞按1×103/孔個接種于96板，每孔培養體積為200μL。隨機分三組：①正常對照組；②PDGF刺激組：50μg/L PDGF；③Valsartan 治療組：0.2mg/mL Valsartan+50μg/L PDGF。從接種次日開始，每天將各組中的4孔細胞進行吸光度值測定，共測7天，每天換液一次。測定時每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，繼續培養4h，棄去培養液，加入二甲亞砜150μL，震蕩10min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀在490nm處測定各孔吸光度值（OD值）。

1.4 ELASA法檢測兔RPE細胞培養液TGF-β1含量

將第3代兔RPE細胞接種于96板，每孔培養體積為200μL，置于37℃，5%CO2培養箱中孵育72h后，隨機分三組：①正常對照組；②PDGF刺激組： 50μg/l PDGF；③Valsartan 治療組：0.2mg/ml Valsartan+50μg/l PDGF，每組設4個復孔，繼續培養72h后，取上清液用ELASA法測定TGF-β1含量，操作按試劑盒進行。

1.5 統計學分析

所有數據以?±s表示，采用SPSS13.0統計軟件分析。兔RPE細胞增殖實驗采用析因方差分析，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用檢驗，p<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE細胞增殖。經析因方差分析,三組差異具有顯著性（=34.620，＝0.000）；不同時間點對細胞體外增殖的影響差異具有顯著性（=107.860，＝0.000）；各組細胞與各時間組兩因素交互效應顯著（=89.55，＝0.000）；除第1、2天外，其他各時間點細胞組間的細胞增殖差異具有顯著性（表1）。經LSD 法多重比較，結果表明，與正常對照組相比較，PDGF刺激組兔RPE細胞的增殖速度加快，而Valsartan治療組對PDGF刺激后的兔RPE生長有明顯抑制作用。

表1 不同處理因素、不同時間點對兔RPE細胞增殖的影響（X±s，n=4）

注：*主效應的統計量和值；＃交互效應的統計量和值。

2.2 Valsartan抑制PDGF刺激兔RPE細胞分泌TGF-β1

PDGF刺激兔RPE細胞大量分泌TGF-β1，與正常對照組比有顯著性差異，而Valsartan則明顯抑制PDGF刺激兔RPE細胞分泌TGF-β1（表2）。

表2 不同處理因素對兔RPE細胞分泌TGF-β1的影響 （ng/L，X±s，n=4）

注：值為165.759，值為0.000，*與正常對照組比0.000，#與PDGF刺激組比0.000。

3 討論

PVR是玻璃體視網膜手術失敗的主要原因，且迄今為止無特別有效的治療手段。PVR的發生機理是由視網膜表面及玻璃體內細胞的增殖，主要是RPE細胞、膠原細胞及成纖維細胞增殖形成增殖膜，增殖膜收縮引起視網膜脫離（RD）導致視力喪失。大量研究表明RPE細胞在PVR的發生發展過程中起主導作用，RPE通過分化、轉分化，分泌細胞因子，表達細胞因子受體，參與細胞外基質形成通過復雜的細胞因子網絡引發“瀑布式”級聯反應，導致PVR的發生[5]。TGF-β1即是PVR病理過程中的主要作用因子之一。在PVR病理過程中PDGF分泌增加，并刺激RPE增殖，促進PVR進展。

纈沙坦（Valsartan）是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，臨床上廣泛用于治療高血壓病，是一種安全有效的降壓藥物。最近的實驗室研究顯示血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能有效減輕組織纖維化程度，有效抑制肝臟、腎臟、心臟、胰腺等臟器的纖維化，其機制可能與抑制組織細胞內的TGF-β1及TGFRⅡmRNA表達有關。

TGF-β1已有實驗證明在PVR形成過程中起復雜的雙向調節作用，不同濃度時對RPE細胞分別表現出促進或抑制作用。TGFβmRNA及其蛋白水平的升高可使視網膜色素上皮細胞分泌釋放多種生長因子，刺激活化的巨噬細胞和成纖維細胞，使其產生膠原和纖維粘連蛋白等物質，導致PVR的進展。

本實驗初步證實Valsartan可通過抑制RPE表達、分泌TGF-β1，抑制RPE增殖。作用機制需進一步實驗室研究，Valsartan對PVR的抑制作用有待進一步體外動物實驗證實。

[1] Pastor CJ,Proliferative vitreoretinopathy;an overview[J].Surv Ophthalmol,1998,43(1):3-18.

[2]姜美華,涂玲,徐西振,等.心肌纖維化細胞模型的構建及纈沙坦對其治療的研究[J].醫學導報.2008,27(7):739-742.

[3] Casaroli-Marano RP,Pagan R,Vilaro S.Epithelial-mesenchymal transition in proliferative vitreoreinopathy:intermediate filament protein expression in retinal pigment epithelial cells.Invest Ophthalmol[J]. Vis Sci,1999,40(9):2062-2072.

[4] 徐國興,楊娟,孫堂勝,等.體外原代培養人視網膜色素上皮細胞[J].國際眼科雜志,2004,4(1):12-15.

[5] Xu GX,Thoreson WB. Effects of lysophosphatidic acid on DNA synthesis and proliferation in cultured human retinal pigment epithelial cells[J]. Investigative Ophthalmology&Visual Science (suppl),1997,38（3）:671.

1.福建省衛生廳青年科研基金（編號2007-29）；2.福建省重點科研課題（基金編號2008Y0040）。