視網膜色素上皮細胞培養上清液聯合視黃酸對骨髓間充質干細胞的誘導分化作用

馮月蘭 徐國興 謝茂松

視網膜色素上皮細胞培養上清液聯合視黃酸對骨髓間充質干細胞的誘導分化作用

馮月蘭1、2徐國興1謝茂松1

1．福建醫科大學附屬第一醫院眼科中心 2.內蒙古科技大學附屬第一醫院眼科

目的：探討人類視網膜色素上皮(human retinal pigment epithe—lialium，hRPE)細胞培養上清液聯合全反視黃酸（all-trans Retinoid Acid，RA）對骨髓間充質細胞(bone marrow stromal cells.BMSCs)誘導分化的影響。方法：實驗分3組：RPE+RA+ BMSc共培養組,RPE+ BMSc共培養組,對照組。體外培養人視網膜色素上皮細胞(hRPE)和大鼠骨髓間充質干細胞(BMSc),取第2代HRPE和第3代BMSCc接種于Transwell雙層培養板內共培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，采用免疫細胞化學染色檢測膠質源性纖維酸性蛋白(GFAP)、神經元特異性標志物烯醇化酶(NSE)、光感受器特異性標志視紫質(Rhodopsin)在誘導細胞中的表達。結果：hRPE培養上清液+BMSCs+RA組誘導BMSCs更多的表達GFAP (84.57士6.68)％，NSE(56.29士6.51)％,和Rhodopsin (41.47士3.76)％；與RPE培養上清液+BMSCs組及單獨BMSc組相比組間差異有統計學意義。結論：RPE培養上清液+BMSCs+RA可以誘導BMSCs向神經元、膠質細胞與視細胞分化。

骨髓間充質干細胞 視網膜色素上皮細胞 全反視黃酸 共培養 誘導分化

BMSCs是來源于骨髓的非造血干細胞，具有多潛能分化特性。與存在倫理學爭議的胚胎干細胞及增殖能力有限的視網膜祖細胞相比，BMSCs以其具有自體同源性、易分離和操作簡單等顯著優勢，成為視網膜細胞移植治療的理想供體。已有研究表明，視網膜細胞培養上清液能夠體外誘導胚胎干細胞向神經細胞分化[1]。本研究旨在探討BMSCs誘導分化的條件培養基。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

THERMO FORMA 3111 CO2培養箱（美國）；AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）；OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本）；OLYMPUS PMCB20攝影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光學顯微鏡（日本）。

1.2 試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均為Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、實驗用體重為80g清潔級sD大鼠。培養基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；抗體為鼠抗人角蛋白-18單克隆抗體（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神經元特異性標志烯醇化酶（NSE），星形膠質細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經膠質酸性蛋白(GFAP)，光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(Rhodopsin)，(均為Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 hRPE細胞的取材、原代、傳代培養及鑒定

采用眼杯消化法[2]，沿角鞏緣后3.5mm環形剖開眼球，棄除眼前節、玻璃體及神經視網膜獲得眼杯，用0.25%胰酶消化獲取HRPE細胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培養液培養，細胞接近融合狀態時進行傳代培養。將第二代hRPE細胞置入六孔板中，孔板中放入18×18蓋玻片，利用免疫細胞化學EnVision法檢測角蛋白表達。

1.3.2 BMSCs的分離培養，傳代培養及鑒定

清潔級SD大鼠，無菌條件下取出雙側股骨，從股骨干和脛骨干中間剪斷，用10mLDMEM/F12培養液+20%FBS+肝素反復沖洗骨髓腔，沖洗液經200目不銹鋼標準篩過濾掉大的團塊后充分吹打混勻獲取細胞懸液，接種于25cm2培養瓶中，置于37℃ 5%CO2的培養箱內培養。3d后首次換液，換液時倒除舊的培養液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培養液。當第3代MMSC細胞融合達80%~90%時，利用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90表達對細胞純度進行鑒定[3]。

1.4 實驗分組

1.4.1 hRPE培養上清液+BMSCs+RA組：取二代hRPE細胞懸浮液含2000個細胞接種在transwell六孔雙層培養板的上層，將BMSCs接種于下層培養板中，接種密度2.0×103個細胞/孔，在雙層六孔板的每孔中加入終濃度為1μmol/L的RA，同時在下層放入18mm×18mm蓋玻片進行細胞爬片，隔天換液。（還是每日半定量換液）倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.4.2 hRPE培養上清液+BMSCs組：取二代HRPE細胞懸浮液含2000個細胞接種在六孔transwell六孔雙層培養板的上層，將MSC接種于下層培養板中，接種密度2000個細胞/孔，同時在下層放入18 mm×18mm蓋玻片進行細胞爬片，隔天換液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.4.3 單獨BMSc置于六孔板中爬片

2周后取出蓋玻片進行GFAP，NSE， Rhodopsin，細胞化學染色。

1.5 免疫細胞化學染色

將雙層六孔板中爬有HRPE和誘導前、后的BMSCs的玻片取出。

PBS潤洗3min×3次；

4％多聚甲醛室溫下固定20min，PBS沖洗3min ×3次；

0.1％TritonX.100室溫下處理l0min，PBS沖洗3min ×3次；

3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶PBS沖洗3min ×3次；

羊血清孵育20min，封閉非特異性結合，勿洗；

適當稀釋度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育過夜，PBS沖洗3min ×3次；陰性對照片為用PBS 代替一抗；

二抗（生物素標記的羊抗鼠IgG抗體）37℃濕盒孵育30min，PBS沖洗；

DAB顯色6min；

蘇木素復染；

中性樹膠封片。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、傳代培養參照文獻[2]、[3]報告的方法

2.2 誘導分化的細胞形態學觀察及鑒定

hRPE培養上清液+BMSCs+RA組共培養3d后原來梭行的BMSCs 胞體已發生收縮，呈錐形，細胞邊緣變得不規整，有零星的細的突起（圖1A）。在誘導后14d后，BMSCs 呈漸進性的向神經元樣細胞轉化，有較多的長突起，有些長突起末端形成生長錐樣的膨大及絲性偽足呈典型的核周體形態，多極狀（圖1B）；同時BMSC在誘導7D后，部分細胞發生遷移并相互之間建立突觸聯系(圖1C)。與ｈRPE培養上清液+BMSCs+RA組相比，不加RA則分化細胞明顯減少，也少有建立突觸聯系的細胞（圖1D）。

A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；單獨BMSCs:D:×400；

2.3 統計學結果分析

利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統分別對兩種誘導條件下GFAP、NSE、Rhodopsin表達進行定量分析。

圖2 不同指標與光密度關系

表1 不同誘導條件下光密度統計結果

陽性細胞統計結果見圖3、表2。

圖3 不同指標所表達陽性率

表2 不同誘導條件下所表達指標陽性率統計分析

3 討論

BMSCs是目前備受關注的一群具有多向分化潛能的成體干細胞。具有高度可塑性，在一定誘導條件下具有向成骨細胞、成軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞以及基質細胞等中胚層細胞分化的能力。近年來，BMSCs 向神經細胞的分化研究受到了極大的關注。本試驗所用到的RA是一種維生素A的代謝產物，它可以影響脊椎動物的發育和許多類型細胞的分化。RA常被用來進行誘導多潛能干細胞向神經細胞分化的研究，但機制尚不明確。RPE 細胞可分泌多種細胞因子這些細胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一種多效的神經營養因子。對中樞及外周神經系統的許多部位的神經元具有神經營養、神經保護和神經分化作用；bFGF能誘導體內視網膜的重建，刺激所有源自中胚層的細胞以及許多源自神經外胚層和內胚層細胞的增生；bFGF可介導神經元的分化、對光感受器具有重要的保護作用；TGF2β可在正常RPE 細胞中表達。可調控細胞生長、分化、細胞外基質合成。本試驗將三者共培養兩周，結果顯示：BMSCs可以高表達神經膠質細胞及神經元細胞特異性標志GFAP和NSE，同時我們還驚喜地發現誘導分化后的BMSCs表達光感受器細胞特異性標志Rhodopsin。這進一步證明了，BMSCs不僅可以向非間充質細胞轉化，還可以跨胚層由起始的中胚層向外胚層發育，這為臨床上進一步治療視網膜和視神經疾病奠定了基礎。

[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 – 370.

[2] Xu GX．In Vitro Primary Culture ofHuman RPE[J]．Int J Opbtbalmol,2004：4(1)：l2.

[3] 謝茂松,徐國興等.大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養[J].國際眼科雜志,2007,7（5）:1285-1287.

福建省重點科研課題(基金編號：2008Y0040)。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。