中國(guó)福州呼吸道感染患兒中檢測(cè)到WU多瘤病毒

修文瓊 劉光華 沈曉娜 王美愛(ài) 謝劍鋒 康育蘭 翁其珠 嚴(yán)延生

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中國(guó)福州呼吸道感染患兒中檢測(cè)到WU多瘤病毒

修文瓊1劉光華2沈曉娜1王美愛(ài)1謝劍鋒1康育蘭2翁其珠2嚴(yán)延生1

1.福建省疾病預(yù)防控制中心 2.福建省婦幼保健院

呼吸道感染是造成全球5歲以下兒童死亡的主要疾病，也是兒童住院治療的首要疾病。迄今，仍約有30%的小兒呼吸道感染原因不明[1]。人類呼吸道病毒種類繁多，小兒呼吸道感染可由不同病毒引起，以往的研究證明嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病毒病原是人類呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(甲、乙型) 、副流感病毒(主要是Ⅰ、Ⅲ型) 、腸道病毒和腺病毒。最近幾年，從人類呼吸道標(biāo)本中又鑒定出7種先前未知的病毒，分別是人偏肺病毒[2]，SARS冠狀病毒[3]，冠狀病毒NL63[4]，冠狀病毒HKU1[5]，人博卡病毒[6]，以及2007年剛被發(fā)現(xiàn)的KI多瘤病毒（KIPyV,)[7]和WU多瘤病毒(WUPyV,)[8]。WUPyV和KIPyV屬于多瘤病毒科的兩種人類呼吸道新病毒，含有雙鏈環(huán)狀基因組DNA結(jié)構(gòu)，是一類小DNA病毒。

為了了解這幾種呼吸道新病毒在本地區(qū)小兒中的感染情況，我們從2007年11月至2008年10月采集了在福建省福州市婦幼保健院因呼吸道感染住院的重癥監(jiān)護(hù)病房的57例小兒鼻咽抽取物標(biāo)本，并用分子生物學(xué)方法對(duì)幾種呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)。另外，對(duì)一例有腹瀉癥狀的急性呼吸道感染門診患兒的痰、嘔吐物和排泄物標(biāo)本分別進(jìn)行了疑似病毒的檢測(cè)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

采集57例因下呼吸道感染住院患兒（臨床診斷為支氣管炎或肺炎、毛細(xì)支氣管炎）的鼻咽抽取物（NPA，nasopharyngeal aspirates）標(biāo)本及一例門診患兒的痰、嘔吐物標(biāo)本和糞便標(biāo)本?；颊吣挲g從20天到4歲，平均年齡5.3月，中位年齡2.1月。82.5%為男孩，17.5%為女孩。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本處理

在3mL DMEM采樣液中加入采集的NPA標(biāo)本，反復(fù)吹打在40C條件下送達(dá)的NPA標(biāo)本，加入雙抗（含200U/mL青霉素，200U/mL鏈霉素），分裝數(shù)管，置-700C保存。嘔吐物和糞便標(biāo)本同樣分裝數(shù)管，置-700C保存。如果糞便標(biāo)本較濃，可制備10%便懸液。具體方法是將糞便標(biāo)本加到1.5mL Ep管中，加入生理鹽水振蕩3次，每次10sec，然后靜置10 min，8 000 g離心5 min，吸上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或置-700C保存。

1.2.2病毒DNA的提取

提取前將標(biāo)本凍融兩次后，10 000 g離心15min，吸取上清。采用德國(guó)Qiagen 公司的QIAamp Viral DNA Mini Kit，按其手冊(cè)所提供的方法提取病毒DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增鑒定

一對(duì)檢測(cè)引物[8]為AG0044（5‘TGTTACAAATAGCTGC AGGTCAA），AG0045（5‘GCTGCATAATGGGGAGTACC），擴(kuò)增產(chǎn)物為VP2蛋白的一段，長(zhǎng)250bp；另一對(duì)確認(rèn)引物[8]為AG0048（5‘TGTTTTTCAAGTATGTTGCATCC），AG0049（5‘CACCCAAAAGACACTTAAAAGAAA），擴(kuò)增產(chǎn)物為大T抗原（LTAg）的一段，長(zhǎng)244bp。引物由TaKaRa（大連）有限公司合成。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化及序列測(cè)定

采用德國(guó)Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit，按其手冊(cè)所提供的方法純化PCR產(chǎn)物。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，克隆質(zhì)粒為pMD18T。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取將PCR產(chǎn)物片段克隆到質(zhì)粒的白色菌落，提取質(zhì)粒后測(cè)序。

1.2.5基因比對(duì)分析

將所測(cè)得的序列與GenBank中多株WUPyV的基因片段的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。多序列比對(duì)由ClustalX完成，進(jìn)化樹(shù)分析采用Phylip3.65軟件。同時(shí)也對(duì)推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。所測(cè)得的4株WUPyV部分基因或全基因組的GenBank序列號(hào)是FJ890979（FZ13株）, FJ890980（FZTO株）, FJ890981（FZ18株）, FJ890982（FZTF株）。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)

從57例鼻咽抽取物（NPA）標(biāo)本中檢測(cè)到3例WUPyV感染陽(yáng)性標(biāo)本，編號(hào)分別為FZ9、FZ13和FZ18，陽(yáng)性率為5.3%。在另一門診病例的痰、嘔吐物標(biāo)本和糞便標(biāo)本中也檢測(cè)出WUPyV感染，編號(hào)分別為FZTO和FZTF。若加上這一門診病例，58例呼吸道感染患兒中，WUPyV感染的檢出率為6.9%。用檢測(cè)引物和確認(rèn)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物的相對(duì)分子量分別是250bp和244bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定和比較分析

對(duì)5株WU多瘤病毒中的兩株FZ18株和FZTF株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，并對(duì)另兩株病毒FZ13株和FZTO株的大T抗原和小T抗原的部分編碼基因進(jìn)行序列測(cè)定，所測(cè)定的FZTO株與FZTF株的基因序列是一致的，分別對(duì)應(yīng)同一門診患兒的嘔吐物和糞便標(biāo)本。將FZ18株與FZTF株基因的250bp檢測(cè)片段與已上傳到GenBank的國(guó)內(nèi)外幾株WUPyV的基因片段（澳大利亞的B0、B3、B7、B9、B12株，美國(guó)的S1、S2、S3、S4株，韓國(guó)的KY-M-2338、KY-M-3293、KY-M-3302株，北京的BCH-004A、BCH-123A、BCH-312A、BCH-313A株，溫州的CLFF株和蘭州的LZ41株，對(duì)應(yīng)GenBank序列號(hào)分別是澳大利亞的EF444549、EF444558、EF444580、EF444592、EF444557，美國(guó)的EF444550-EF444553，韓國(guó)的EF655820、EU041606、EU041608，北京的EU597008、EU754876、EU754881、EU754882，溫州的EU296475和蘭州的EU304322）進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)出的氨基酸序列的比對(duì)分析。圖1顯示中國(guó)福建福州的FZ18株和FZTF株與其它已報(bào)道的18株WUPyV的親緣關(guān)系?？梢?jiàn)相對(duì)而言，福州FZ18株與的北京BCH-004A株距離較近，F(xiàn)ZTF株則與蘭州的LZ41株、溫州的CLFF株、韓國(guó)的3株及參考株-澳大利亞的B0株和美國(guó)的S1-S4株關(guān)系較近。FZ18株和FZTF株基因的250bp檢測(cè)片段與B0株相比，F(xiàn)ZTF株未發(fā)生突變，F(xiàn)Z18株的核苷酸序列在1545bp處有一堿基突變，推導(dǎo)出的氨基酸序列亦不同,基因的此處突變?yōu)镸324I。FZ18株的此處突變與北京BCH-004A株相同。

圖1 福建2株人WU多瘤病毒（FZ18、FZTF）與Genbank中其它18株人WUPyV的VP2基因氨基酸序列的親緣關(guān)系樹(shù)

2.3 陽(yáng)性病例的臨床癥狀

這5例患兒都為男童。FZ18號(hào)患兒才48天，2008年一月份發(fā)病，咳嗽兩天，加重，氣促半天；FZ13號(hào)患兒4個(gè)月，反復(fù)咳嗽10天以上，加劇，伴氣喘2天，臨床診斷為支氣管肺炎。FZ9號(hào)患兒2個(gè)月，咳嗽7天，加劇，伴氣喘、氣促1天；FZ13號(hào)和FZ9號(hào)病兒都在2007年12月份發(fā)病。另一患兒是門診病例，3歲半，也是2007年12月初發(fā)病，突然嘔吐，腹瀉，伴有咳嗽，醫(yī)生診斷為急性病毒性胃腸炎。分別收集他的痰、嘔吐物（FZTO）和排泄物（FZTF）進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序，所測(cè)得的序列是一致的。5個(gè)月后，這位患兒又咳嗽、嘔吐和腹瀉，但未在其痰、嘔吐物標(biāo)本和排泄物標(biāo)本中檢測(cè)到WUPyV感染。總之，這幾個(gè)患兒都在冬季發(fā)病，都有呼吸道感染癥狀，咳嗽等；有一門診患兒還有胃腸道感染癥狀。在57例住院患兒中WUPyV感染陽(yáng)性病例年齡中位數(shù)是2個(gè)月，平均數(shù)是2.6個(gè)月。

2.4 其它病毒感染情況

對(duì)這些標(biāo)本也進(jìn)行了兩種常見(jiàn)呼吸道病毒-流感病毒（包括甲1、甲3和乙型）和呼吸道合胞病毒（RSV）及其它幾種呼吸道新病毒：如人博卡病毒（HBoV）、人偏肺病毒（HMPV）和KI多瘤病毒（KIPyV）的檢測(cè)。對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行了人A組輪狀病毒（RVA）的檢測(cè)。檢測(cè)到2例甲3亞型流感病毒、1例乙型流感病毒感染和32例RSV感染及2例HBoV感染、1例KIPyV感染。也檢測(cè)到兩種病毒的混合感染，其中3例檢測(cè)出WUPyV的住院患兒都檢測(cè)出與RSV的混合感染；1例檢測(cè)出HBoV的患兒也檢測(cè)出與乙型流感病毒的混合感染；另一例檢測(cè)出甲3亞型流感病毒與RSV的混合感染。WUPyV與其它呼吸道病毒混合感染的檢出率是75.0%。

3 討論

多瘤病毒在全球大多數(shù)哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類中都存在，其中研究最多的感染動(dòng)物的多瘤病毒是鼠多瘤病毒和猴空泡病毒（SV40）。1971年，兩種人類多瘤病毒BK和JC病毒分別從進(jìn)行同種異體移植的慢性腎盂腎炎病人的尿和進(jìn)展性多病灶腦白質(zhì)腦病的病人腦中分離出。BKPyV和JCPyV可引起持續(xù)性感染，在有免疫力的人中通常無(wú)癥狀，但在那些免疫抑制的病人中可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病[9]，這兩種病毒均與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，有報(bào)導(dǎo)在呼吸道分泌物中也發(fā)現(xiàn)BKPyV[10]。2008年,在人類皮膚癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種多瘤病毒科新病毒MCPyV ()[11]，最新報(bào)導(dǎo)在人呼吸道分泌物中也發(fā)現(xiàn)MCPyV[12]。在人類糞便標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)有BKPyV, JCPyV[13]和KIPyV[7]。最近報(bào)導(dǎo)在兒童急性胃腸炎的糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)WUPyV[14]，我們也在一位既有呼吸道感染癥狀又有急性胃腸炎癥狀的門診病人的痰、嘔吐物和糞便標(biāo)本中檢測(cè)到WUPyV感染，而從這位患兒的呼吸道標(biāo)本中未檢測(cè)到常見(jiàn)呼吸道病毒如RSV和流感病毒的感染，也未檢測(cè)出其它幾種呼吸道新病毒。這表明雖然WUPyV是呼吸道病毒病原，但也可在胃腸道的排泄物中存在，WUPyV似乎既可引起上、下呼吸道感染，也可引起腹瀉。以前的研究也表明了WUPyV感染既表現(xiàn)出呼吸道癥狀，也表現(xiàn)出胃腸道癥狀[7,15-17]。因此，推測(cè)WUPyV類似于人類其它多瘤病毒，既可通過(guò)呼吸道也可通過(guò)胃腸道傳播。我們?cè)诹?例檢測(cè)出WUPyV感染的住院患兒中都檢測(cè)出了RSV的感染，因此WUPyV在人類呼吸道感染中的臨床意義有待進(jìn)一步研究。

2007年報(bào)道在美國(guó)華盛頓地區(qū)鑒定WUPyV的陽(yáng)性率為0.7%[8]，在密蘇里地區(qū)為2.7%[18]，在澳大利亞為3.0%[8]，在加拿大為2.5%[19]，在韓國(guó)WUPyV的陽(yáng)性率高達(dá)7.0%[20]，并且有混合感染情況出現(xiàn)，與其它一些呼吸道病毒混合感染的檢出率是67.6%。中國(guó)最早報(bào)道了浙江一例WUPyV感染[21，22]，蘭州的感染率是2.2%[23]，北京的感染率是2.4%[24]。2008年報(bào)道WUPyV在法國(guó)的感染率是2.4%[25]，德國(guó)的感染率是4.9%[26]，英國(guó)的感染率是1.08%[27]，并且有混合感染情況，與RSV、HBoV和HMPV混合感染的檢出率是75%，類似于我們的檢測(cè)結(jié)果。由于我們都沒(méi)有檢測(cè)鼻病毒、腺病毒、冠狀病毒和腸道病毒等其它幾種呼吸道病毒，否則混合感染的檢出率更高。近來(lái)，美國(guó)報(bào)道在有呼吸道感染癥狀的兒童中WUPyV的陽(yáng)性率為7.1%，無(wú)癥狀兒童中的陽(yáng)性率為6.3%[28]；荷蘭報(bào)道在兒科重癥監(jiān)護(hù)病房，有或無(wú)呼吸道感染癥狀的兒童中WUPyV的陽(yáng)性率為2.6%[29]。在我們的研究中，同一門診病人經(jīng)過(guò)5個(gè)月后（次年4月份），又出現(xiàn)呼吸道感染和腹瀉癥狀時(shí)，但我們沒(méi)有再次從他的痰液、嘔吐物或排泄物標(biāo)本中檢測(cè)到WUPyV，表明WUPyV沒(méi)有潛伏在其體內(nèi)形成持續(xù)性感染。顯然WUPyV的感染可發(fā)生在生命早期，也可能是使呼吸道疾病加重的一個(gè)因子。但WUPyV作為人類病原以及它的致病性有待進(jìn)一步研究和闡明。

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