腸道病毒71型（EV71）感染性克隆的構建

楊秀惠 嚴延生

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腸道病毒71型（EV71）感染性克隆的構建

楊秀惠 嚴延生

福建省疾病預防控制中心

腸道病毒71是小RNA病毒科腸道病毒屬中的一員，常在嬰幼兒中引起手足口病的大范圍爆發流行，并能導致重癥、甚至死亡病例的發生。1998年中國臺灣地區129106例的手足口病例及78例死亡主要由EV71引起[1]，2008年和2009年以EV71感染為主引起的手足口病在中國大陸多個省市流行，并導致479名兒童死亡[2]。這些手足口病疫情使越來越多的研究針對EV71致病機制、病毒變異與毒力以及疫苗開發。

反向遺傳技術為在DNA水平上對RNA病毒進行研究和操作提供了極為方便有用的工具。本研究構建了EV71全長cDNA克隆,并將體外轉錄得到的RNA轉染RD細胞,成功獲得拯救病毒，為進一步研究EV71病毒基因功能、基因變異與病毒毒力關系、基因疫苗等研究以及防控該病奠定良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1毒株與細胞

EV71病毒株FJ08149是2008年從一手足口病病例皰疹液分離獲得，經鑒定為EV71 C4基因亞型。RD細胞由中國疾病預防控制中心脊灰實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑

長片段擴增Primescript RT-PCR Kit購自Takara公司；PCR-XL- TOPO TA載體 購自Invitrogen公司；RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 購自Promega 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 購自Qiagen公司；EV71單克隆抗體購自Chemicon公司；FITC標記的二抗購自Dako公司。

1.2 引物設計與合成

根據FJ08149株的序列和酶切位點,設計了一對引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7啟動子序列及I酶切位點，下游引物EV71-3RM在其5'端引入52個Poly(T)及I酶切位點。由Takara公司合成。

1.3 RT-PCR擴增基因片段

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑說明提取病毒RNA,最后用適量無RNA酶的雙蒸水溶解。根據長片段Primescript RT-PCR Kit說明書，先以EV71-3RM為反轉錄引物，在42℃反應1小時反轉錄全長cDNA，然后利用Takara Ex Taq HS進行基因組全長擴增，PCR反應條件為:95℃預變性3 min；98℃ 10sec , 68℃ 9min，40個循環；72℃ 10min。反應產物在0.7%瓊脂糖中電泳進行檢驗。

1.4 全長cDNA 的構建與鑒定

RT-PCR擴增產物經電泳后純化，以TA克隆方法將帶有T7啟動子識別序列的基因組全長連入TOPO-XL-PCR載體中，用I和I酶切鑒定是否插入目的片段。

1.5 體外轉錄與轉染RD細胞

用Ⅰ和I將有目的片段插入的質粒進行雙酶切線性化，純化后按照T7體外轉錄試劑盒說明在體外轉錄出RNA，用RNeasy mini kit（Qiagen）試劑盒進行RNA純化后,加30ul無RNA酶的雙蒸水洗脫, 定量。按照Transfection reagent說明書要求把RNA轉染到培養于6孔細胞板RD細胞中, RNA含量為2μg/孔。轉染后每天觀察細胞，待細胞病變（CPE）達到75%及以上或觀察7天后，收獲細胞進行鑒定與傳代。

1.6 拯救病毒的鑒定

1.6.1 RT-PCR鑒定及VP1序列測定

用EV71－S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)診斷引物對拯救病毒進行鑒定。應用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)擴增包括VP1全長在內的1082bp產物，并進行序列測定分析。

1.6.2間接免疫熒光試驗鑒定

CPE達到75%及以上或觀察7天后，收集細胞及上清，2500rpm離心10min，取細胞沉淀用無菌PBS洗2次后，重懸細胞沉淀，滴加到熒光片，用丙酮將其固定，蒸鎦水清洗1次后加入EV71單克隆抗體，37℃濕盒中孵育1 h，PBS 洗滌3次。加入用1∶6000伊文斯蘭以1∶40 稀釋的FITC標記的兔抗鼠二抗，37℃濕盒中孵育1h，PBS洗滌3 次后甘油封孔，鏡檢。

1.6.3拯救病毒效價測定

獲得拯救病毒經RD細胞傳一代擴增后，與母本病毒同時進行TCID50測定。詳細方法及步驟參見《WHO脊髓灰質炎病毒實驗室手冊》[3]。

1.6.4電鏡觀察

獲得拯救病毒經RD細胞傳一代擴增后，反復凍融3 次，4500r/min 離心30 min，取上清濃縮5倍后，以1%加入EV71特異性抗體37 ℃孵育2h后，4℃過夜，10000r/min離心30 min，以PBS重懸沉淀，點樣、負染，電鏡觀察。

2 結果

2.1 全長cDNA克隆的構建

利用引物EV71-5T7和EV71-3RM，從FJ08149病毒上清擴增出EV71基因組全長約7.5kb，見圖1A（marker不夠清晰）。應用TA克隆技術，將EV71基因組全長連接入PCR-XL-TOPO TA載體中，構建重組質粒，經I和I雙酶切鑒定，FJ08149T5和FJ08149T25兩個克隆質粒均有目的基因插入，見圖1B,目的基因約7.5kb，載體大小為3.5kb。

A: FJ08149株基因組PCR擴增產物

2.2 體外轉錄制備感染性RNA

應用I和I雙酶切，從pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆質粒中切下含有T7啟動子的基因組DNA。并將此片段作為體外轉錄模板，通過T7 RNA聚合酶系統，體外轉錄成RNA，經電泳鑒定，轉錄的RNA達到預期的7.5Kb大小，見圖2。

1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25

2.3 病毒的拯救

轉錄RNA轉染RD細胞后72小時，即可見到典型的腸道病毒CPE，見圖3A，CPE呈逐日增多，7天后將轉染細胞培養上清以20%比例傳代，第3天CPE達到75%以上。對照細胞培養7天均仍保持正常形態，見圖3B。

A.轉染pFJ08149T5后的RD細胞 B. 正常的RD細胞

2.4 拯救病毒的鑒定

2.4.1間接免疫熒光鑒定

拯救病毒、拯救病毒傳1代后和母本病毒株用EV71單克隆抗體進行免疫熒光檢測，均可見到特異性的熒光，見圖4A，而細胞對照無熒光產生，見圖4B。

圖4 拯救病毒的間接免疫熒光鑒定

2.4.2RT-PCR鑒定及序列分析

拯救病毒培養上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R進行擴增，均得到預期大小的目的片段，約226bp和1082bp，見圖5。將VP1全長序列測定分析，拯救病毒與母本病毒891個堿基完全一致。

圖5 拯救病毒的RT-PCR鑒定

2.4.3拯救病毒毒力效價測定

將拯救病毒與母本病毒同時進行病毒效價測定，結果pFJ08149T5的效價為105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效價為107.25TCID50/0.1mL，母本病毒FJ08149的效價為107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25與母本病毒對細胞的感染力相近，而pFJ08149T5約低100倍。

2.4.4病毒粒子的形態

濃縮后的FJ08149T5拯救病毒與EV71抗體作用后，形成免疫復合物，經負染色，電鏡下觀察到球形病毒粒子，直徑約22nm，見圖6。

圖6 拯救病毒的免疫電鏡

3 討論

自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次應用反向遺傳學技術成功拯救出脊髓灰質炎病毒（PV）后[4]，翻開了RNA病毒研究的新篇章，實現了在DNA水平上研究RNA病毒。通過構建cDNA感染性克隆，應用DNA基因操作方法，如定點突變、重組、缺失和嵌合等手段，研究拯救病毒基因水平的改變對表型的影響，進而達到對病毒基因功能與結構、致病機制、表達調控、分子免疫機理等的全面認識，開發出新型疫苗。日本學者Arita等，于2005年首先構建了EV71標準株BrCr的感染性克隆，然后利用基因置換，引入PV疫苗株（Sabin I）影響溫度敏感與病毒毒力的突變位點，在猴子模型上證實了溫度敏感的病毒株對猴子毒性減弱[5]；2008年，他們又在NOD/SCID鼠模型中證實了幾個決定溫度敏感的突變位點在神經毒力減弱中起協同作用[6]。2008年以來EV71在中國大陸流行，迫切需要利用本土流行株構建感染性克隆，為研究其致病機理、病毒變異與毒力關系以及疫苗的研究提供技術支持。

由于PV等小RNA病毒的基因組是單股正鏈RNA分子，裸RNA分子就具有感染性，且基因組較小，如EV71等腸道病毒屬僅有7.5Kb大小，無帽子結構。理論上構建其感染性克隆可能較為容易，但在實際操作中仍然面臨著不少的困難。首先需獲得完整基因組的cDNA序列，先前基本上采取分段擴增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列，操作過程煩瑣，且多次克隆、連接也給基因序列突變增加了機率。本研究中通過長片段RT-PCR一次性擴增出全長基因組，一次克隆操作以盡量減少可能引入序列變異。第二，基因組3’端需有足夠長的Poly(A)尾，一定長度的Poly(A)對維持基因組穩定性及保證其感染性均有作用[7]。據報道，PV的Poly(A)如果少于20個，RNA的感染性比野生株會低20倍[8]。Sarnow等對3’端Poly(A)組成不同對PV體外轉錄本感染性影響的研究得到，Poly(A)尾越長其感染性越接近野生株，但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究設計時利用3’端引物直接帶入52個Poly(A)尾和一個I酶切位點，達到保證感染性同時可進行線性化的目的。第三，保證基因組忠實性，減少其它非基因組序列引入。本研究直接將T7啟動子特異性識別序列通過引物精確加到基因組5’端，并帶入I酶切位點，轉錄前通過雙酶切，避免將載體序列引入。第四，克隆擴增時如何避免因細菌增殖可能引起的序列變異，導致序列缺失或插入從而導致基因組序列不完整性。在本研究過程中也曾發現過類似的情況，因此采用了28℃、150rpm/min的低溫低轉速的優化培養條件，這是乙型腦炎病毒等其它感染性克隆構建過程也曾采取的措施[9]。本研究還發現如果基因組正向插入到載體T7啟動子下游，不僅細菌增殖緩慢且量少，質粒拷貝數低，且轉染也無感染性；而如果基因組以反向插入，則細菌不僅增殖快量大，質粒拷貝數高，且所獲得的幾株感染性克隆均為此反向插入的。這是否因不同方向插入時，潛在表達的蛋白質不同導致的，有待于進一步深入研究分析。

本研究應用本地分離株成功地構建了中國大陸流行C4基因亞型EV71感染性克隆，轉染RD細胞成功獲得了拯救病毒，經鑒定與野生株具有相似的遺傳特性與生物學性狀。此感染性克隆構建成功，可為下游研究提供了技術支持。

[1] Lin TY, Twu SJ, Ho MS, et al .Enterovirus 71 outbreaks, Taiwan: occurrence and recognition. Emerg Infect Dis. 2003,9: 291–293.

[2] http://www.chinacdc.net.cn/n272442/n272530/n272757/appendix/doc7307.doc

[3] 世界衛生組織.脊髓灰質炎實驗室手冊[R].第4版.中國疾病預防控制中心：北京, 2004：78-96.

[4] Racaniello VR, Baltimore D.Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in Mammalian cells. Science. 1981，214(11)：916-919.

[5] Arita M, Shimizu H, Nagata N, et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005，86：1391-1401.

[6] Arita M, Ami Y, Wakita T, et al. Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model. J Virol, 2008，82(4)：1787-1797.

[7] Sarnow P.Role of 3’-end sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro. J Virol, 1989， 63(1)：467-470.

[8] Spector DH，Baltimore D. Requirement of 3'-terminal poly(adenylic acid) for the infectivity of poliovirus RNA.Proc Natl Acad Sci，1974，71：2983-2987.

[9] 黃鶯,賈麗麗,孫志偉,等.流行性乙型腦炎病毒(JEV)全長感染性克隆的制備及恢復病毒的獲得[J].病毒學報，2003，19（4）：313-319.