酵母轉(zhuǎn)化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2體系條件

肖霄, 倪元穎, 李淑燕, 胡錦榮, 張京聲, 孫君社, 劉 萍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

酵母轉(zhuǎn)化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2體系條件

肖霄, 倪元穎, 李淑燕, 胡錦榮, 張京聲, 孫君社, 劉 萍＊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

超臨界CO2作為非水相介質(zhì)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化茄尼醇生成輔酶Q10的底物和產(chǎn)物具有良好的溶解作用,但對(duì)微生物的存在會(huì)產(chǎn)生一定影響,選擇合適的超臨界CO2體系條件有利于輔酶Q10產(chǎn)量的提高。通過研究超臨界CO2流體的壓強(qiáng)、酵母細(xì)胞在超臨界CO2流體中的反應(yīng)時(shí)間、添加介質(zhì)種類以及添加量等條件對(duì)粟酒裂殖酵母細(xì)胞活性和輔酶Q10產(chǎn)量的影響,確定對(duì)酵母細(xì)胞生存影響較小并顯著促進(jìn)輔酶Q10生產(chǎn)的超臨界CO2體系條件為:超臨界CO2壓強(qiáng)為10.5 M Pa,反應(yīng)時(shí)間為16 h,向菌體中添加菌體濕重3倍的培養(yǎng)基,超臨界CO2流體中輔酶Q10的產(chǎn)量達(dá)到55.71μg/m L。比液體深層發(fā)酵培養(yǎng)輔酶Q10產(chǎn)量提高97.5%。研究結(jié)果表明,通過優(yōu)化酵母轉(zhuǎn)化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2體系條件,可以顯著提高酵母細(xì)胞生成輔酶Q10的能力。

超臨界CO2流體;菌體活性;輔酶Q10;茄尼醇;體系條件

輔酶Q10(CoQ10)是呼吸鏈上一個(gè)脂溶性的輔酶,參與呼吸鏈中的電子和質(zhì)子傳遞,且其還原型醌環(huán)結(jié)構(gòu)可以有效地清除自由基,被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品添加劑等領(lǐng)域[1]。茄尼醇與輔酶Q10的側(cè)鏈——異戊二烯焦磷酸在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性,這為茄尼醇作為前體物質(zhì)實(shí)現(xiàn)CoQ10的微生物轉(zhuǎn)化提供了理論基礎(chǔ)[2-3]。作者所在的研究組前期研究發(fā)現(xiàn),利用生物轉(zhuǎn)化法可以將茄尼醇直接轉(zhuǎn)化為CoQ10,但由于茄尼醇不溶于水,限制了其進(jìn)入酵母細(xì)胞,顯著影響該物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率,而生成的產(chǎn)物輔酶Q10也微溶于水,產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累顯著地抑制其產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。超臨界CO2流體具有良好的溶解能力和傳質(zhì)特性,Comp ton等[4]在超臨界流體中進(jìn)行了皺褶假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶催化膽甾醇和乙烯乙酸酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)研究,膽甾醇在超臨界乙烷中的溶解度提高了600多倍。因此超臨界CO2流體可以一定程度上緩解反應(yīng)的產(chǎn)物抑制作用,但超臨界CO2流體對(duì)微生物的發(fā)酵過程產(chǎn)生的影響說法不一[5-6]。有關(guān)粟酒裂殖酵母在超臨界體系中的存活及其轉(zhuǎn)化茄尼醇生產(chǎn)輔酶Q10的情況在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道,本研究結(jié)果可為輔酶Q10的生產(chǎn)提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharom yce spromb)2·1794,原菌種購自中科院微生物所,經(jīng)作者所在研究室紫外聯(lián)合亞硝基胍誘變獲得能夠轉(zhuǎn)化茄尼醇生成CoQ10的菌株S.prombB2·1794-23。HA 121-50-02超臨界設(shè)備購自江蘇南通華安超臨界萃取公司,反應(yīng)釜體積為5 L。CO2(純度99.99%)購自北京京城氣體。Agilent A 1200液相色譜系統(tǒng)購自安捷倫公司,配有SPD紫外檢測(cè)器。

1.2 主要培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基(組分g/dL):葡萄糖 2,蛋白胨 2,酵母浸提物 1;p H 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(組分 g/dL):葡萄糖 1.5,蔗糖1.5,蛋白胨 1.0,酵母膏 1.0 ,M gSO40.01,K2HPO40.01,KH2PO40.01;p H 5.0。

1.3 菌體培養(yǎng)物的制備

將粟酒裂殖酵母S.prombB2·1794-23接于種子培養(yǎng)基中,在28 ℃下,以160 r/min振蕩培養(yǎng)18 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將種子接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(裝于250 m L三角瓶),28℃條件下以160 r/m in振蕩培養(yǎng)18 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將上述所得發(fā)酵液分別裝入編好序號(hào)的50 m L離心管中,每管30 mL,以4 000 r/min離心收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,濾紙上倒置10 s,稱重。

1.4 細(xì)胞存活率的測(cè)定方法

血球計(jì)數(shù)板結(jié)合美蘭染色法。

1.5 輔酶 Q10的提取及檢測(cè)方法

從超臨界CO2體系中取出的細(xì)胞,用生理鹽水洗滌一次,以4 000 r/min離心收集菌體,每管中加入10 m L pH 6.0、0.1 mol/L的磷酸緩沖液,加入15 uLβ-巰基乙醇,37℃下置于220 r/min搖床反應(yīng)1 h;然后每管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的蝸牛酶,相同條件搖床中反應(yīng)3 h。將每管離心收集菌體,加入10 m L丙酮,渦旋混勻后冰浴超聲破碎細(xì)胞,超聲功率300 W,超聲5 s,間歇6 s,超聲60次。破碎后以4 000 r/min離心,將上清液倒入圓底燒瓶中真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),用 5 m L無水乙醇定容待測(cè)。HPLC檢測(cè)條件:色譜柱為150 mm×4.6 mm,直徑為5μm的Agilent C18柱,流動(dòng)相為無水V乙醇∶V水=98∶2,流速 1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 275 nm,進(jìn)樣量20μL,柱溫28 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 超臨界CO2條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)輔酶 Q10產(chǎn)生菌活性以及輔酶Q10產(chǎn)量的影響

在超臨界設(shè)備反應(yīng)釜內(nèi)放入收集到的菌體,在溫度為31℃、壓強(qiáng)為7.5 M Pa條件下,分別保壓1、3、5、8、16、19 h 后 ,按 0.25 M Pa/min 的速度卸壓(以此速度卸壓可能導(dǎo)致細(xì)胞破裂,但由于卸壓時(shí)預(yù)期轉(zhuǎn)化過程已結(jié)束,因此不影響所考察過程的結(jié)果),測(cè)得菌體細(xì)胞存活率和輔酶Q10產(chǎn)量。結(jié)果表明,在19 h內(nèi),細(xì)胞存活率變化不大,僅在1～3 h及16～19 h時(shí)存活率略低于5～16 h,這可能由于前3個(gè)小時(shí)是細(xì)胞適應(yīng)高壓厭氧環(huán)境的過程,16～19 h由于長(zhǎng)時(shí)間處于超臨界CO2高壓厭氧環(huán)境中,細(xì)胞中積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗,一些代謝酶活性降低,導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡,且活細(xì)胞的繁殖能力有所下降,因此導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。1～16 h輔酶Q10產(chǎn)量一直呈上升趨勢(shì),前5小時(shí)上升速率較快,可能由于1～3 h細(xì)胞處于適應(yīng)高壓厭氧環(huán)境的階段,在脅迫環(huán)境中會(huì)生成大量輔酶Q10用于保護(hù)線粒體呼吸鏈[7-8]。3 h后,細(xì)胞度過適應(yīng)期并大量繁殖,因此輔酶Q10迅速積累,在16 h時(shí)達(dá)到42.36μg/m L。16 h后輔酶Q10產(chǎn)量開始下降,可能由于細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞存活率及部分代謝酶活性都在下降而導(dǎo)致,見圖1。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率及輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of reaction time in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

2.2 超臨界CO2壓強(qiáng)對(duì)輔酶 Q10產(chǎn)生菌活性以及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響

將收集到的細(xì)胞放入31℃超臨界 CO2體系下 ,分別在壓強(qiáng)為 7.5、9、10.5、13.5 M Pa 時(shí)保壓反應(yīng)8 h,按0.25 M Pa/m in的速度卸壓,然后測(cè)定菌體細(xì)胞存活率和輔酶Q10產(chǎn)量。結(jié)果見圖2。

圖2 超臨界CO2壓強(qiáng)對(duì)細(xì)胞存活率及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of reaction pressure in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

細(xì)胞存活率隨壓強(qiáng)沒有明顯變化,可能是在31℃條件下,壓強(qiáng)達(dá)到7.5 M Pa以上,CO2都以超臨界流體的形式存在,對(duì)細(xì)胞存活影響的差異不大。Debs-Louka等人[9]以糞鏈球菌、啤酒酵母、埃希氏大腸桿菌3種微生物為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)3種微生物的失活速度在3.5 M Pa以下對(duì)壓強(qiáng)的變化不敏感。Lin H-M等人發(fā)現(xiàn)不同微生物細(xì)胞對(duì)CO2作用的抵抗力不同,這可能由于不同微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜特性不同,對(duì)CO2分子的透過性不同。在壓強(qiáng)低于13.5 M Pa時(shí),粟酒裂殖酵母細(xì)胞對(duì)壓強(qiáng)變化不敏感,細(xì)胞存活率維持在80%～86%。輔酶Q10產(chǎn)量在壓強(qiáng)為10.5 M Pa時(shí)達(dá)到最大,可能由于在10.5 M Pa條件下,超臨界CO2流體對(duì)輔酶Q10的溶解性較好,能更好的消除產(chǎn)物抑制作用,利于輔酶Q10的生成,且在此壓強(qiáng)下細(xì)胞存活率為86%,說明大部分細(xì)胞可以保持良好的生理活性,因此選擇超臨界CO2體系的壓強(qiáng)為10.5 M Pa時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。

2.3 超臨界CO2體系中反應(yīng)介質(zhì)種類及添加量對(duì)輔酶 Q10產(chǎn)生菌活性以及輔酶Q10產(chǎn)量的影響

在收集的菌體中分別加入每管菌體濕重1～4倍的蒸餾水、生理鹽水、培養(yǎng)基作為反應(yīng)介質(zhì),將其放在超臨界設(shè)備反應(yīng)釜內(nèi),在溫度31℃、壓強(qiáng)7.5 M Pa條件下保持不同時(shí)間后,按0.25 M Pa/min的速度卸壓,測(cè)得菌體細(xì)胞存活率和輔酶Q10產(chǎn)量,結(jié)果見圖3。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下蒸餾水添加量對(duì)細(xì)胞存活率及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of distilled water in scCO2 on cellssurvival and CoQ10 yield

隨著蒸餾水添加量的增加,細(xì)胞存活率與輔酶Q10產(chǎn)量都大致呈下降趨勢(shì),在1、5、8 h時(shí),輔酶Q10產(chǎn)量雖有波動(dòng),但總體都低于未添加蒸餾水的樣品。由此說明,在該超臨界CO2體系下,添加蒸餾水不利于菌體保持活性,并相應(yīng)使輔酶Q10產(chǎn)量減少。原因可能是在超臨界狀態(tài)下含水量增大對(duì)細(xì)胞膜透性有一定影響,CO2較容易通過細(xì)胞膜,進(jìn)入菌體內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的p H值下降和酶失活。

在1 h和16 h條件下,細(xì)胞存活率隨著生理鹽水添加量的增加呈略微下降趨勢(shì);在5 h和8 h條件下,分別在添加3倍和1倍質(zhì)量的生理鹽水時(shí),細(xì)胞存活率略有升高。在輔酶Q10產(chǎn)量方面,與對(duì)照未添加生理鹽水的樣品相比,8 h添加2倍生理鹽水時(shí),輔酶Q10產(chǎn)量有較大幅度提高,1 h和5 h影響不明顯,16 h雖然在添加3倍生理鹽水時(shí)與其他添加量有明顯提高,但比對(duì)照未添加生理鹽水時(shí)作用不明顯。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是在超臨界條件下,生理鹽水中的鈉離子和氯離子在細(xì)胞生命代謝中起重要作用,Na+影響細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓和電化學(xué)梯度平衡,刺激代謝產(chǎn)物 H+釋放到胞液中,改變細(xì)胞內(nèi)外局部的p H值,影響相關(guān)酶活,見圖4。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間下生理鹽水添加量對(duì)細(xì)胞存活率及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of normal saline in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

在1 h條件下,細(xì)胞存活率隨著培養(yǎng)基添加量的增加緩慢降低,輔酶Q10產(chǎn)量基本保持平穩(wěn);5 h和8 h條件下添加1倍培養(yǎng)基,細(xì)胞存活率略高于其他培養(yǎng)基添加量條件,輔酶Q10產(chǎn)量都隨培養(yǎng)基添加量升高呈下降趨勢(shì)后又明顯升高。16 h添加1倍培養(yǎng)基時(shí),細(xì)胞存活率明顯下降,之后隨添加量增加變化不大,輔酶Q10產(chǎn)量在添加1倍培養(yǎng)基時(shí)亦明顯下降,添加3倍培養(yǎng)基時(shí)達(dá)到最高,為55.71μg/m L。圖5可能由于細(xì)胞在放入超臨界CO2體系較短時(shí)間內(nèi),未能適應(yīng)環(huán)境變化,另外細(xì)胞培養(yǎng)過程中貯存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還未被消耗掉,所以培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)保持其活性的作用不大。隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng),細(xì)胞體內(nèi)原有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗,需要培養(yǎng)基補(bǔ)充保持活性和生產(chǎn)輔酶Q10所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間下培養(yǎng)基添加量對(duì)細(xì)胞存活率及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of culture medium in scCO2 on cells survival and CoQ10 yield

2.4 超臨界CO2體系與液體深層培養(yǎng)對(duì)輔酶 Q10產(chǎn)生菌活性以及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響

將收集到的菌體中加入菌體濕重3倍的培養(yǎng)基,一組放入搖床中于28℃條件下,以160 r/min振蕩培養(yǎng)16 h;另外一組放入超臨界設(shè)備反應(yīng)釜內(nèi),在31 ℃、壓強(qiáng)7.5 M Pa條件下保持16 h。將兩組取出后測(cè)定細(xì)胞存活率和輔酶Q10產(chǎn)量,結(jié)果見圖6。液體深層培養(yǎng)的酵母細(xì)胞存活率略高于超臨界CO2體系,差異不明顯,但超臨界 CO2體系中的輔酶Q10產(chǎn)量比液體培養(yǎng)高出97.5%,證明經(jīng)過優(yōu)化后的超臨界CO2體系條件可以明顯地促進(jìn)輔酶Q10產(chǎn)量的提高。

圖6 超臨界CO2體系與液體深層培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞存活率及輔酶 Q10產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of scCO2 and liquid submerged culture on cells survival and CoQ10 yield

3 結(jié) 語

超臨界CO2條件下,添加合適的介質(zhì)如生理鹽水和培養(yǎng)基將有利于細(xì)胞的存活和輔酶Q10的生成。有利于粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化茄尼醇生成輔酶Q10的超臨界CO2條件是:壓強(qiáng)10.5M Pa、反應(yīng)時(shí)間16 h,添加濕菌體質(zhì)量3倍的培養(yǎng)基,輔酶Q10產(chǎn)量比液體深層培養(yǎng)提高了97.5%。

（References）：

[1]廖滿媛,閆紅,李佩衍.輔酶Q10的合成研究進(jìn)展[J].北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,28(2):155-159.

L IAO Man-yuan,YAN Hong,L IPei-yan.Progress of researeh on CoQ10synthesis[J].Journal of Beijing Polythchnic U-niversity,2002,28(2):155-159.(in Chinese)

[2]Comp ton D L,King JW.Lipase-catalyzed synthesis of triolein-based sunscreens in supercritical CO2[J].J Am Oil Chem Soc,2001,78(1):43-48.

[3]Wei C I,Balaban M O,Fernando S Y et al.Bacterial effect of high pressure CO2treatment on foods spiked withL isteriaorSalmonella[J].J Food Prot,1991,54(3):189-193.

[4]葉盛英,丁德坤,宋賢良,等.不同參數(shù)超臨界CO2對(duì)乳酸菌活性的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2007,23(2):218-222.

YE Sheng-ying,D INGDe-kun,SONG Xian-liang,et al.Effects of different parameters of supercritical CO2treatment on the mcrobial activity ofLactobacillus[J].Transactions of the CSAE,2007,23(2):218-222.(in Chinese)

[5]L IN Ho-mu,YANG Zhi-ying,CHEN Li-fu.Inactivation ofSaccharom yces cerevisiaeby supercritical and subcritical carbon dioxide[J].Biotechnol Prog,1992,8:458-461.

[6]陳堅(jiān),堵國(guó)成,衛(wèi)功元,等.微生物重要代謝產(chǎn)物[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:149-150.

[7]黃建華,邱然,楊文洲,等.金屬離子對(duì)啤酒酵母發(fā)酵中生成乳酸的影響[J].食品科技,2007,7:122-124.

HUANG Jian-hua,Q IU Ran,YANG Wen-zhou,et al.Effect of metal ionson lactic acid during yeast metabolism[J].Food Science and Technology,2007,7:122-124.(in Chinese)

[8]管敦儀.啤酒工業(yè)手冊(cè)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1998:144.

[9]袁靜,魏泓.微生物發(fā)酵生產(chǎn)CoQ10的研究進(jìn)展[J].氨基酸和生物資源,2004,26(1):53-56.

YUAN Jing,WEI Hong.Recent progress of ubiquinone-10 production by microbial fermentation[J].Amino Acids and Biotic Resources,2004,26(1):53-56.(in Chinese)

Supercritical CO2Conditions of CoQ10Biotransformation from Solanesol by Schizosaccharom yces prombe

XIAO Xiao, N I Yuan-ying, L IShu-yan, HU Jin-rong, ZHANG Jing-sheng,
SUN Jun-she, L IU Ping＊
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Supercritical CO2(scCO2)as non-aqueous media could well dissolve substrates and products of coenzyme Q10(CoQ10)biotransformation reaction from solanesol,but it also had effects on microbial activity,so appropriate scCO2conditions could imp rove CoQ10yield.The effects of scCO2on the catalytic activity ofSchizosaccharom yces prombe(S.promb)and CoQ10yield in different conditions were studied. The appropriate scCO2conditions which could significantly promote the production of CoQ10and could have little negative effects on the cells survival was:triple of cells’wet weight of culture medium was added into the reaction system.,kept the pressure at 10.5 M Pa for 16 h,the production of CoQ10is 55.71μg/mL,imp roved 97.5%.The results showed that optimization of scCO2reaction system conditions could significantly imp rove the production of CoQ10.

supercritical carbon dioxide,cells activity,CoQ10,solanesol,conditions

＊

劉萍(1970-),女,吉林省吉林市人,工學(xué)博士,副教授,主要研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程和生物制藥。Email:liuping@cau.edu.cn

TQ 464.8

A

1673-1689(2010)02-0302-05

2009-03-15

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(5062022)。

(責(zé)任編輯:李春麗)