虎奶菇菌絲體胞外多糖深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

孟凡杰（農(nóng)村成人高等專科學(xué)校，吉林 梨樹 136500）

虎奶菇［Pleurotus tuber-regium（Fr.）Sing］又名核耳菇，隸屬側(cè)耳科的菌核，生于森林內(nèi)土中的腐木或木樁上，是產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)的一種珍稀食藥用菌，我國云南省滕沖、章風(fēng)一帶有分布，滇西南一帶民間多從緬甸進口，資源十分緊缺。據(jù)《中藥藥名辭典》載：虎奶菌，甘，溫，補氣益血，治氣血虛弱癥。在東南亞國家華僑中及我國沿海地區(qū)，虎奶主要作為強壯補品食用，在一些民間處方中，為一味止咳平喘中藥。但虎奶菌作為一種中藥材在我國藥典和各地地方標準中并未被收載；目前在非洲的尼日利亞、加納、肯尼亞等正在引種栽培。福建三明也成功地引種栽培。據(jù)報道虎奶菇富含蛋白質(zhì)、多糖等活性物質(zhì)和鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。非洲一些國家用虎奶菇治療胃病、糖尿病、冠心病、高血壓等疾病；虎奶菇還能促進胎兒發(fā)育，提高早產(chǎn)兒成活率；東南亞各國用虎奶菇菌核治療痢疾。據(jù)報道，虎奶菇菌核入藥，外敷有治療婦女乳腺炎之效。迄今我國尚未開發(fā)利用。由于虎奶菇人工栽培周期長、產(chǎn)量低、成本高，為了開發(fā)利用虎奶菇資源，從國外引種進行栽培和發(fā)酵培養(yǎng)的深入研究是十分必要的。已知從各種真菌中分離出具有生物活性的物質(zhì)常為多糖［1-7］、靈芝多糖、灰樹花多糖等已用于腫瘤的臨床治療。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在虎奶菌核中多糖為其主要成分，占菌核干重的60％［8］。本文就虎奶菇菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

虎奶菇：購于山東濟寧光大食用菌科研中心。

1.1.2 碳源

葡萄糖，果糖，木糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，玉米淀粉，馬鈴薯，糊精。

1.1.3 氮源

酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，豆粕粉，麩皮。

1.2 主要儀器設(shè)備

回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床柜（無錫查橋輕機廠）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；

立式圓形壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠）；

80-2型離心機（上海器械廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯20g（煮沸20min過濾取濾液）、葡萄糖2g、瓊脂2g、水100g、pH值自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯250g（切碎煮沸30min，用4層紗布過濾，取濾液），蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，KH2PO41g，MgSO40.6g，水1000g，pH值自然。

1.3.2 培養(yǎng)方法

平皿培養(yǎng)：從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于培養(yǎng)皿的中部，于25℃培養(yǎng)7d。

液體種子培養(yǎng)：將已活化的平板菌定量接種于液體種子培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝培養(yǎng)基50mL，于25℃，150r/min搖瓶培養(yǎng)7d。

搖瓶條件實驗：在發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中接入液體種子，變化相應(yīng)搖瓶條件進行實驗，分別測定菌體干重與胞外多糖量。

1.3.3 測定方法

菌體干重（Wd）：所得發(fā)酵液于3000r/min離心20min，去離子水洗滌后用sartrius自動水分干燥儀干燥至恒重。

總糖（Wts）：苯酚-硫酸法

胞外多糖（Wl）：發(fā)酵濾液多糖

2 結(jié)果與討論

由于虎奶菇在我國產(chǎn)量較少，引種栽培也剛剛起步，液體深層發(fā)酵培養(yǎng)更不成型，買的這株菌常規(guī)培養(yǎng)下產(chǎn)量就很不穩(wěn)定，因此需要進行簡單優(yōu)化。

2.1 碳源對菌絲生長及多糖產(chǎn)量的影響

圖1 不同碳源菌體干重和多糖含量

虎奶菇作為一種擔子菌，它對碳源的利用也應(yīng)該相當廣泛，但是不同的碳源對菌絲生長及多糖產(chǎn)量的影響會很大。葡萄糖、果糖、麥芽糖和糊精等都是虎奶菇菌絲體較為理想的碳源，尤其以馬鈴薯和蔗糖為最佳，虎奶菇菌絲體在果糖中比在葡萄糖中生長要好，說明酮糖比醛糖更容易被虎奶菇菌絲體利用，這一結(jié)論也可以從蔗糖、麥芽糖的結(jié)果差異上得到證明，麥芽糖是以兩個葡萄糖為單位連接而成的雙糖，蔗糖則為葡萄糖和果糖組成的雙糖，結(jié)果虎奶菇菌絲體在以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長量和多糖產(chǎn)量都高于麥芽糖。因此，綜合考慮采用蔗糖和馬鈴薯組成的復(fù)合碳源。

2.2 氮源對菌絲生長及多糖產(chǎn)量的影響

由于擔子菌使用無機氮作為氮源時，菌絲必須利用無機氮合成其需要的各種氨基酸，而某些氨基酸可能不能被菌體生物合成，從而影響菌絲的生長［22］。因此作者沒有選用無機氮，只選擇酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕粉和麩皮。結(jié)果表明除豆粕粉以外，其他四種氮源差別不大，用酵母膏時多糖產(chǎn)量略高一些，為0.521mg/mL，而用蛋白胨時菌體量略高一些，為1.003g/100mL，因此選用酵母膏和蛋白胨作為復(fù)合氮源較理想。使用豆粕粉為氮源時，產(chǎn)量非常低，這是作者沒有想到的。

2.3 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成

以上單因子實驗表明，蔗糖、馬鈴薯、酵母膏和蛋白胨是影響虎奶菇菌絲生長和多糖產(chǎn)量的主要營養(yǎng)因子。為考慮多因子的協(xié)同作用，并確定最適用量和配比，以得到經(jīng)濟有效的虎奶菇菌絲體培養(yǎng)基組成，選用蔗糖、馬鈴薯、酵母膏和蛋白胨等四因子，各取三水平，進行正交試驗。

表1 正交試驗因素水平表L9（34）

極差分析表明，各因素對虎奶菇菌絲體干重的影響程度為：A＞B＞C=D，也就是說蔗糖是菌絲體生長的最主要因素（R=0.099），菌絲體生長理論上的最優(yōu)組合為A3B1C1D2，即蔗糖3g/100mL，馬鈴薯20g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。對胞外多糖影響的最優(yōu)組合為A2B3C2D2，即蔗糖2g/100mL，馬鈴薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。

由于培養(yǎng)虎奶菇菌絲體的目的為產(chǎn)多糖，結(jié)合投入與產(chǎn)出比，選擇碳氮源的配比為：蔗糖2g/100mL，馬鈴薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。

表2 正交試驗結(jié)果的極差分析

3 結(jié)論

虎奶菇多糖深層發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成（g/L）為∶蔗糖2g/100mL，馬鈴薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。在此條件下發(fā)酵產(chǎn)虎奶菇胞外多糖達0.5mg/100mL以上。

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