青木香發酵后總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定

劉學湘, 潘揚, 蔣亞平, 楊英, 蔡江濤

(南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210029)

青木香發酵后總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定

劉學湘, 潘揚＊, 蔣亞平, 楊英, 蔡江濤

(南京中醫藥大學藥學院,江蘇南京 210029)

以靈芝、槐耳等20個真菌為菌種、青木香藥材為基質,運用固體發酵技術,在一定的條件下進行發酵試驗,篩選出13個菌種能在青木香藥材上生長良好,表明這些菌種能與藥材形成較好的發酵組合形成發酵品。采用反相 HPLC二元梯度洗脫法測定13種青木香發酵品中馬兜鈴酸Ⅰ(AA Ⅰ)的含量及紫外分光光度法(UV)測定這些發酵品中總馬兜鈴酸(TAA)含量。HPLC測定表明,13種青木香發酵品主要腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ均有不同程度的下降,其中有6種發酵品的馬兜鈴酸Ⅰ的下降率在50%以上;UV測定發現,這些發酵品中總馬兜鈴酸含量均有所下降,下降率最高者為46.76%,最低者為7.61%;HPLC和UV綜合(加權)分析表明,13種真菌(均以代號表示)對青木香腎毒性成分的降解能力由大至小依次排列如下:F-1>F-2>F-5>F-6>F-8>F-13>F-4>F-11>F-3>F-9>F-10>F-12>F-7。提示不同真菌發酵可在不同程度上降低中藥青木香中腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ和總馬兜鈴酸的含量。

青木香;真菌發酵;總馬兜鈴酸;馬兜鈴酸Ⅰ;含量測定

青木香為馬兜鈴科植物馬兜鈴的干燥根,具有平肝止痛,解毒消腫的作用,臨床上用于眩暈頭痛,胸腹脹痛,癰腫疔瘡,蛇蟲咬傷等。2004年,SFDA取消了青木香的藥用標準,處方和制劑中以土木香(菊科植物土木香或總狀土木香的干燥根)代替。土木香為藏藥,在植物來源、功能主治、化學成分、藥理作用和臨床應用等方面與青木香均有所不同,兩者不應相互替代[1]。有鑒于此,如何去除青木香等含馬兜鈴酸類中藥材中腎毒性成分并保持其原有的藥效,一直是近年來研究的熱點問題。

目前對此類藥物研究最多的為關木通,使用的手段有炮制[2]、復方配伍[3]和改變入藥形式[4]等,也有采用微生物發酵的方法[5],但對青木香的相關報道較少。作者前期研究以靈芝、槐耳等20個真菌為菌種、青木香藥材為基質,運用固體發酵技術,在一定的條件下進行發酵試驗,篩選出13個菌種能在青木香藥材上生長良好,表明這些菌種能與藥材形成較好的發酵組合形成發酵品(結果將另文發表)。作者建立反相高效液相法(HPLC)測定13種青木香發酵品中馬兜鈴酸Ⅰ含量,以及紫外分光光度法(UV)測定這些發酵品中總馬兜鈴酸含量,觀察不同真菌發酵對中藥青木香中腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ和總馬兜鈴酸含量的影響,旨在為探索發酵法對含馬兜鈴酸類中藥材的“去毒存效”奠定良好的物質基礎。

1 實驗方法

1.1 儀器與材料

Shimadzu LC-10A T高效液相色譜儀:日本島津公司產品;Waters 2695高效液相色譜-質譜聯用儀:美國沃特斯公司產品;UV-2401 PC紫外可見分光光度儀:日本島津公司產品;立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KB:上海申安醫療器械廠產品;超凈工作臺403:江蘇無錫縣空氣凈化設備廠產品;隔水式電熱培養箱 PYX-DHS:上海醫療器械七廠產品;SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器:江蘇金壇國勝儀器廠產品;A E240電子天平:M ETTLER公司產品;202型電熱恒溫干燥箱:上海索普儀器有限公司產品;FW 80型微型高速萬能試樣粉碎機:齊家務科學儀器廠產品。

青木香藥材,購自南京鹿江中藥飲片廠,批號:20070728,經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為馬兜鈴科植物馬兜鈴(A ristolochia debilisSieb.etZucc)的干燥根;馬兜鈴酸Ⅰ對照品,購自中國藥品生物制品檢定所,批號:110746-200305,純度大于98%;乙腈為色譜純(TED IA),自制重蒸水,其他試劑均為分析純。

20個真菌菌種均由南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所提供,其中13個菌種的代號分別如下:F-1、F-2、F-3、F-4、F-5、F-6、F-7、F-8、F-9、F-10、F-11、F-12和 F-13。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵處理 按固體發酵的生產工藝進行操作[6]。將青木香粉碎成粗粒(過10目篩),加適量水濕潤,p H自然,填裝試管,混合均勻,扎口,121℃高壓滅菌50 m in,冷卻,作為發酵基質用;從菌種斜面上切取綠豆粒大小的一塊菌絲體連同培養基,移入發酵基質的表面(兩者須有接觸),扎口,置于培養箱中28℃恒溫培養,定期觀察并記錄生長情況。發酵30 d后,取出,60 ℃下干燥24 h,備用。

1.2.2 HPLC法測定馬兜鈴酸Ⅰ含量 參照文獻方法[7],自行確定了馬兜鈴酸 Ⅰ二元梯度洗脫HPLC定量分析條件。

(1)系統適應性試驗:色譜柱為 Hanbon C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相:乙腈(A)-體積分數0.2%醋酸水溶液(B)進行梯度洗脫,0～ 25 m in,15%A→30%A;25～45 m in,30%A →50%A;45～55 min,50%A →60%A;55～75 min,60%A →80%A;75～80 min,80%A →15%A;流量:1.0 mL/min;檢測波長:250 nm;柱溫:30 ℃;運行時間:80 m in,梯度平衡時間:10 m in。該條件下對照品峰與樣品中其他色譜峰基本達到基線分離,理論板數按馬兜鈴酸Ⅰ峰計算不低于15 000。

(2)對照品溶液的制備:稱取馬兜鈴酸Ⅰ對照品4 mg,置10 m L量瓶中,加甲醇約7 mL,置水浴上微熱使溶解,冷卻至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,即得(每mL含馬兜鈴酸Ⅰ為0.4 mg)。

(3)線性關系的考察:吸取對照品溶液25、50、100、200和250μL,分別置1 m L量瓶中,加甲醇至刻度 ,搖勻 ,即得質量濃度分別為 10、20、40、80、100 μg/mL的馬兜鈴酸Ⅰ溶液。照前述色譜條件分別進樣10μL,測定,記錄峰面積值。以峰面積為縱坐標(Y)、對照品質量濃度(μg/m L)為橫坐標(X),繪制標準曲線。結果表明:回歸方程為Y=3.74×106X– 13 916(r=0.999 5),馬兜鈴酸Ⅰ在10～100μg/mL范圍內線性關系良好。

(4)供試品溶液的制備:取干燥青木香發酵品(或藥材)2 g,粉碎(過60目篩),稱重,置于100 m L圓底燒瓶中,加體積分數60%甲醇20 m L,浸泡30 min后,水浴回流1 h,過濾,濾液蒸干,殘渣以甲醇定容至50 mL,0.45μm濾膜過濾,濾液供 HPLC分析。

1.2.3 紫外分光光度法測定總馬兜鈴酸含量

(1)線性關系的考察:量取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液(質量濃度為0.4 mg/m L)30,60,120,150,210 μL,分別置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻(質量濃度分別為1.2,2.4,4.8,6.0,8.4μg/m L),在250 nm波長處測定樣品吸收度,以對照品吸收度A為縱坐標、質量濃度(μg/m L)為橫坐標C,繪制標準曲線。結果表明:回歸方程為A=0.1007C+0.001(r=0.999 2),馬兜鈴酸Ⅰ在1.2～8.4μg/m L范圍內呈現良好線性關系[8]。

(2)供試品溶液的測定:吸取上述供試品溶液(2 g→50 m L)60μL,稀釋并定容至10 m L,混勻,以甲醇為參比溶液。在波長250 nm處測定樣品吸光度值,標準曲線法計算樣品中總馬兜鈴酸的質量分數(%)。

2 實驗結果

2.1 菌絲體生長情況

按1.2.1發酵條件得到的13種真菌在青木香藥材上的發酵生長情況詳見表1。

2.2 發酵前后 HPLC比較

發酵前后 HPLC比較見圖1。

2.3 發酵前后樣品中馬兜鈴酸類成分的含量變化

馬兜鈴酸Ⅰ的 HPLC測定結果和總馬兜鈴酸的UV測定結果詳見表1。

圖1 青木香發酵前后的 HPLC比較圖Fig.1 HPLC results of Radix aristolochiae after and before fermentation

表1 青木香13種發酵品各指標變化情況表Tab.1 The parameters of the thirteen fermented products

3 討 論

體積分數選用甲醇-醋酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液以及乙腈與0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%等5種不同體積分數的醋酸水溶液為流動相進行梯度洗脫測定。結果表明:乙腈-醋酸水溶液條件下的色譜峰分離度、峰形、柱效等參數優于甲醇-醋酸水溶液系統;且上述提及的5種不同體積分數的醋酸水溶液對色譜峰的影響并不大,考慮到流動相p H值過低影響色譜柱的使用壽命,故采用乙腈-醋酸(體積分數0.2%)水溶液的二元梯度系統進行測定;還比較了馬兜鈴酸Ⅰ及其它組分在315 nm和250 nm兩個波長處的吸收,250 nm處檢測的靈敏度較高。

在同一發酵條件下,通過約30 d對菌絲體生長情況的觀察,發現其中13種真菌在青木香基質上生長良好,菌絲體發育正常,表明這些菌種與青木香基質相適應。HPLC測定表明,這13種發酵品中青木香基質中腎毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ均有不同程度下降,其中有6種發酵品馬兜鈴酸Ⅰ的下降率在50%以上;其HPLC的化學指紋譜亦有不同程度的變化。通過LC-M S進一步分析,發現這些發酵品除馬兜鈴酸Ⅰ以外,其他馬兜鈴酸類化合物如馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ等含量等均有不同程度的變化,且都出現原藥材所沒有的未知成分(結果將另文發表)。UV測定顯示,13種發酵品中總馬兜鈴酸含量均有所下降,下降率最高者為46.8%,最低者為7.6%;HPLC和UV綜合(加權)分析結果證明,13種真菌(代號)對青木香藥材中主要腎毒性成分的降解能力排列如下:F-1>F-2>F-5>F-6>F-8>F-13>F-4>F-11>F-3>F-9>F-10>F-12>F-7。

發酵是利用真菌中的多種酶使底物(包括中藥材)進行各種各樣的化學反應,如氧化還原反應、脫羧反應、去硝基反應或甲基化反應等而發生轉化。青木香中的主要毒性成分為馬兜鈴酸類化合物,而主要有效成分是揮發油類物質[9]。作者通過13種真菌的固態發酵使馬兜鈴酸類化合物發生了不同程度的降解或轉化,從而達到降低這類有毒成分含量的目的。至于青木香中揮發油類成分發酵前后的變化有待進一步研究。

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Determination of Total Aristolochic Acids and Aristolochic AcidⅠin Radix aristolochiae after Fermentation

LIU Xue-xiang, PAN Yang＊, JIANG Ya-ping, YANG Ying, CAI Jiang-tao
(College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

With Radix aristolochiae as substrate,twenty fungi was test and 13 different fungi were found to be grow n on it.Compare with that of the control,the AAⅠcontent was decreased in those 13 fermentation product,and the AAⅠcontent in 6 fermentation product was lower than 50%,compared with that of the control. Similarly,the TAA contents were also detected to be decrease.Among of them,the highest and lowest rate of decline was 46.76%and 7.61%,respectively.After statistical analysis,the ability to decompose the nephro toxic substances in Radix aristolochiae of the 13 fungi was illustrated as follows(from the strong to the weak):F-1>F-2>F-5>F-6>F-8>F-13>F-4>F-11>F-3>F-9>F-10>F-12>F-7(the symbol of different fungi).Those results indicated that different fungi fermentation could efficient decreasethe nephrotoxic components in Radix aristolochiae.

Radix aristolochiae,fungi fermentation,total aristolochic acids,aristolochic acidⅠ,determination

R 282

A

1673-1689(2010)02-0201-05

2009-04-10

江蘇省教育廳自然科學基金項目(06 KJB360083);江蘇省“青藍工程”項目(2008)。

劉學湘(1973-),女,江西南昌人,講師,理學碩士,主要從事中藥生物技術研究。Email:cyg20020515@yahoo.com.cn

＊通信作者：潘揚(1964-),男,江蘇揚州人,理學博士,研究員,主要從事中藥生物技術研究。Email:y.pan2006@163.com

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(責任編輯:朱明)