PCR法快速檢測肉食品污染沙門菌的實(shí)驗(yàn)研究

趙玉玲,張?zhí)焐?張巧艷

(1.河南省沁陽技術(shù)監(jiān)督局檢驗(yàn)測試中心,河南沁陽 454550;2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005)

沙門菌屬(Salmonella)是腸桿菌科中一大類重要致病菌,感染畜禽后可引起一系列的疾病,成為畜禽肉胴體、畜禽產(chǎn)品污染的重要來源[1],并可通過各種途經(jīng)傳染給人,引起人的食源性疾病。在我國70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門菌引起,而引起沙門菌中毒的食品中,約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品[2]。傳統(tǒng)的檢測方法是先采用非選擇性和選擇性培養(yǎng)基增菌,然后分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等,檢驗(yàn)程序十分繁瑣,且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉,需4～7 d才能完成,因此傳統(tǒng)的檢測方法在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性[3]。本研究應(yīng)用傳統(tǒng)的生化鑒定的方法對受試菌株進(jìn)行了鑒定,同時根據(jù)編碼沙門菌毒力蛋白基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn),成功地建立了沙門氏菌的PCR檢測方法,通過對比為沙門菌的檢測提供了更快速、敏感的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌株 來自某生豬屠宰場生豬胴體體表和肌肉樣品中分離的可疑沙門菌4株。

1.1.2 對照菌株 本研究室保存的鼠傷寒沙門菌C77-31菌株。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基 buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量PCR Marker,購自廣州東盛生物工程公司。細(xì)菌培養(yǎng)基包括肉湯增菌液、三糖鐵瓊脂、選擇培養(yǎng)基和生化鑒定管等,均按國標(biāo)配制或購自上海生工公司。

1.1.4 儀器 自動搖床(ZD-9556ZD)、電泳儀(B IORAD PowerPacBasicT M)凝膠成像分析系統(tǒng)(uV I)、PCR儀(PE2400)。

1.1.5 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表的鼠傷寒沙門菌侵襲基因invA的核苷酸序列,應(yīng)用AB I公司提供的Pr imer express 2.0軟件設(shè)計(jì)出引物,上游的引物：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′;下游的引物：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′。引物擴(kuò)增片段的理論跨幅大小為284 bp,引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌的初步鑒定試驗(yàn) 從BS平板上挑取可疑菌落,革蘭染色、鏡檢,并接種三糖鐵瓊脂(TSI)(先在斜面上劃線,再穿刺底層)、尿素酶瓊脂和賴氨酸脫羧酶,在溫度(36±1)℃下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 生理生化試驗(yàn) 挑取TSI培養(yǎng)物,接種ONPG、氰化鉀、尿素、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇、乳糖等微量發(fā)酵管,在溫度(36±1)℃下培養(yǎng)24～48 h。

1.2.3 PCR鑒定 取待檢菌株和對照菌株于肉湯增菌液1 mL置于Eppendorf管中,37℃搖床3 h后,離心收集菌體,用滅菌蒸餾水洗滌2次,最后用1 mL蒸餾水懸浮,隔水煮沸15 min,8 000 r/min離心15 min,取上清,即成DNA模板溶液。PCR反應(yīng)體積50μL,10×PCR buffer 5μL,dNTPs(2.5 mol/L)4μL,上游引物和下游引物(5 mol/L)各2.5μL,模板溶液7.5μL,Taq酶(3 U/μL)0.7μL,三蒸水27.8μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 m im;94℃變性45 s,60℃返火45 s,72℃延伸5 min,經(jīng)32個循環(huán),最后72℃保溫10 min。配制1%瓊脂糖溶液,按0.5 mg/L加溴化乙啶(EB)制膠,取5μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣,用PCR Marker作對照,40 V電泳1 h。取出凝膠,置紫外燈下觀察,用uV I凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析[4-6]。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)及菌體形態(tài)特征

在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長良好,培養(yǎng)24 h后,形成中等大小、圓形、表面光滑、無色半透明、邊緣整齊的菌落,在鑒別培養(yǎng)基上(麥康凱、SS、伊紅美蘭)為無色菌落,在三糖鐵瓊脂斜面：斜面為紅色,底部變黑并產(chǎn)氣,該分離菌在BS瓊脂上呈黑色,帶有金屬光澤。菌落周圍的培養(yǎng)基呈褐色,伴隨培養(yǎng)時間的延長而變?yōu)楹谏?并有所謂的暈環(huán)效應(yīng)。

2.2 生理生化試驗(yàn)

從平板上挑去對照菌落和可疑的待檢菌落(編號分別為1、2、3、4),將菌落接種于生化鑒定管中于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～7 d,結(jié)果如表1。參照《臨床細(xì)菌學(xué)》(李仲興等主編)具體指標(biāo),可推斷該4株菌均為沙門菌陽性。

表1 沙門氏菌生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical characteristics of theBacterialstrain

2.3 沙門菌侵襲性基因invA的PCR擴(kuò)增

圖1 沙門菌invA基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Agrose electrophoresis of invA in Salmonella

檢測了鼠傷寒沙門菌C77-31菌株(1)和4株可疑沙門菌菌株(2、3、4、5),圖1顯示了引物的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,invA擴(kuò)增片段為284 bp。結(jié)果均出現(xiàn)了與理論值大小相等的條帶。

3 討 論

沙門菌是腸桿菌科中的一個重要菌屬,是人和動物的常見病原菌,可引起人類多種疾病。如食物中毒、胃腸炎、菌血癥、腸熱癥等。隨著社會的發(fā)展和人類文明的進(jìn)步,人們對食物品質(zhì)的要求越來越高,因此準(zhǔn)確、快速地檢測食品中的沙門菌,對于預(yù)防人類沙門菌污染具有十分重要的意義。

本研究中沙門菌檢驗(yàn)方法首先是依靠傳統(tǒng)的方法,采用細(xì)菌分離、生化鑒定等表型方法,所需試劑繁多、過程煩瑣、費(fèi)時費(fèi)力,并且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉,因此,表型檢測方法在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性。為了有效地預(yù)防和控制食品傳播疾病,建立快速、敏感及特異性地檢測食品中沙門菌的方法,就顯得非常必要了。

對比傳統(tǒng)方法,本研究檢測采用PCR檢測方法,大大節(jié)約了檢測時間。在檢測沙門菌的靈敏度時用所提取的DNA樣品,便于靈敏度分析。用PCR技術(shù)檢測豬肉中的沙門菌,結(jié)果具有高度的特異性和敏感性。本試驗(yàn)對可疑被沙門菌污染的樣品都可檢測出來;說明PCR方法用于檢測豬肉中的沙門菌,結(jié)果可靠。同時DNA模板濃度只有0.01 pg還能擴(kuò)增出特異帶,說明PCR方法靈敏度高。

自從PCR及其改進(jìn)技術(shù)用于微生物檢測以來,這一快速、靈敏且特異的方法從DNA分子水平的角度為檢測致病菌提供了有效的手段。在今后的應(yīng)用中,可進(jìn)一步完善,結(jié)合其他技術(shù)以提高其敏感性和特異性,可與免疫磁珠顆粒分離技術(shù)結(jié)合;也可與PCR有關(guān)的分型鑒定技術(shù)結(jié)合,使結(jié)果的判定更為精確?？傊?隨著這一方法的不斷完善,其研究會更深入,應(yīng)用范圍會更加廣泛,在微生物檢測領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用[7]。

[1] 郭勝利.136起食物中毒分析[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1999,3(1)：32.

[2] 趙貴,張華.畜產(chǎn)品中沙門氏菌的危害及檢測方法概述[J].貴州畜牧獸醫(yī),2004,28(3)：21-22.

[3] 陳金頂,索青利,廖明,等.沙門氏菌的invA基因的序列分析與分子檢測[J].中國人畜共患病雜志,2004,20(10)：868-871.

[4] 文其乙.沙門氏菌的基因分型和指紋圖譜分析及其在分子流行病學(xué)中的應(yīng)用[J].中國畜禽傳染病,1994,6：57-59.

[5] 黃金林,焦新安,文其乙,等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測沙門氏菌[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2002,23(3)：5-7.

[6] 黃金林,焦新安,劉佩紅,等.PCR快速檢測沙門氏菌試劑盒的研制與應(yīng)用[J].中國公共衛(wèi)生,2004,20(4)：451-452.

[7] 楊小鵑,吳清平,張菊梅,等.畜禽肉沙門菌和大腸桿菌O157多重PCR檢測研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(3)：470-474.