水源水中微囊藻毒素的遺傳毒性與健康風險評價

王偉琴 ,金永堂 *,吳 斌 ,孫肖瑜 ,龐曉露 ,王 靜 (.浙江大學公共衛生學院,環境醫學系,浙江 杭州30058；.浙江省環境監測中心,浙江 杭州 300)

近年來,一些作為飲用水源的湖泊、水庫等水體富營養化及藍藻水華爆發已嚴重威脅到人民群眾的飲用水安全[1].藍藻水華爆發不僅造成水質下降,而且還釋放出內源性藻毒素,其中微囊藻毒素(MC)是出現頻率最高,危害最嚴重的藻類毒素[2],微囊藻毒素-LR(MC-LR)是我國富營養化水體中毒性較大的常見亞型,能強烈抑制蛋白磷酸酶 1(PP1)和蛋白磷酸酶 2A(PP2A)的活性[3],具有肝臟毒性和腫瘤促進作用[4].常規水處理方法不能完全去除水中的 MC[5],為確保居民飲用水安全,迫切需要對MC污染水體的健康風險進行評價,并提出相應的防制措施.目前對水環境污染物的健康風險評價多使用數學模型和動物模型[6],盡管對水中污染物的遺傳毒性研究較多,但是對人體可能具有的遠期健康效應的評價卻較少.本研究對浙江省101個縣級以上集中式飲用水源水中的176種污染物進行了監測,結果顯示MC是其中分布最廣、且非致癌健康風險最高的污染物.因此,采集 MC污染嚴重的水源水樣,一部分采用樹脂對其中的藻毒素進行濃集,另一部分以水源水稀釋不同濃度的MC-LR純毒素模擬了水中MC不同的污染狀況,檢測與分析了MC對魚的生態毒性和細菌致突變性及水源水中不同濃度的 MC對人體DNA損傷的遠期效應.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CO2恒溫培養箱(美國 Thermo Fisher Scientific公司),DYY-11B型水平電泳儀(北京市六一儀器廠),BX51型熒光顯微鏡及 DP50數碼攝像頭(日本Olympus公司),水族箱(廣東日生公司),真空過濾系統(天津津騰實驗設備有限公司),Autotrace固相萃取儀(美國Zymark公司),旋轉蒸發器(瑞士 Buchi公司),氮吹儀(美國Organomation公司),Oasis HLB 小柱(6mL、500mg, 美國Waters公司).

MC-LR標準品(瑞士Alexis公司),純度95%,用色譜級甲醇稀釋為500μg/mL的母液,-20℃保存;正常熔點瓊脂糖(NMA)、低熔點瓊脂糖(LMA)、溴化乙錠(EB)、葡萄糖-6-磷酸、2-甲氯基-6氯代-9-[3-(2-氯乙基)氨基丙胺]吖啶-2鹽酸(ICR-191) (美國Sigma);RPMI 1640培養基(美國Gibco);柔毛霉素(Pharmacia Italia S.p.A);2-氨基芴(ALDRICH),其余試劑為國產分析純.

1.2 水樣采集和檢測

2008年5月豐水期,采集了浙江省101個縣級以上集中式飲用水水源地的地表水樣(水面下0.5m),檢測了水中MC-LR和MC-RR的含量.

太湖是我國第3大淡水湖,是周圍城市重要的飲用水源地,近年來藍藻污染水體事件常有發生,于2008年5月豐水期,采集了該流域湖州地區城北水廠(記為A)和新塘(記為B) 2地水樣.

1.3 水環境健康風險評價

根據水源地水樣檢測結果,基于美國EPA推薦的水環境健康風險評價模型[7]對檢出 MC致癌與非致癌健康風險進行綜合評價.水健康風險模型將水環境污染與人群健康危害聯系起來,通過收集、整理、解釋各種健康相關資料,包括毒理學研究資料、人群流行病學資料、環境暴露因素資料,以風險度為指標定量描述環境毒物對健康的影響程度.

1.4 水源水中MC的濃集

根據水源水樣監測結果,A、B兩水源水中主要的有機成分為 MC(其中分別含 0.094μg/L MC-LR、0.091μg/L MC-LR),按文獻[8]方法收集樣品,經 0.45μm玻璃纖維濾膜過濾去除懸浮顆粒,通過Oasis HLB小柱進行固相萃取,甲醇、丙酮、二氯甲烷洗柱,洗脫液經旋轉蒸發、N2吹干,DMSO定容,使得濃集物中MC-LR濃度為4.5μg/mL,-20℃避光保存備用.

1.5 水源水中MC的致突變性

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由浙江省疾病預防控制中心惠贈,經菌株生物學特性鑒定,均符合實驗要求.采用苯巴比妥和 5′6-苯黃酮聯合誘導的大鼠肝勻漿作為代謝活化系統(S9),經 Lowry法蛋白定量檢測符合實驗要求.

按照平板摻入法[9]分別對藻毒素濃集物、藻毒素稀釋水樣及純毒素的致突變性進行檢測,以DMSO稀釋水樣濃集物,A、B 2水源水稀釋MC-LR純毒素,各試驗組每皿加入不同濃度的藻毒素濃集物和稀釋水樣,使得濃集物和水樣中MC-LR的濃度為0.01,0.10,1.00,10.00,100.00μg/L (不包括水源水中MC-LR本底值),分別記為濃集物A、B和水樣A、B,并以MC-LR純毒素作為標準濃度序列.

在45℃保溫的頂層瓊脂中加入0.1mL試驗菌株增菌液、0.1mL受試物,需要活化時加 10% S9混合液0.4mL,經37℃ 5% CO2培養48h,觀察計數產生回復突變的菌落數.每個樣品做3個平行皿,同時設陰性對照、陽性對照和自發回變組,重復試驗2次.以受試物的回變菌落數為自發回變菌落數2倍以上,并具有劑量-反應關系者定為陽性.

1.6 水源水中微囊藻毒素的染色體損傷檢測

健康錦鯉(Cyprinus carpiod)購于花鳥市場,體重 25~40g,體長 20cm左右,實驗室水族箱(200L,水溫20~25℃)內適應1周后用于實驗.

參考王維等[10]提出的30h魚背肌染毒法,用微量進樣器將受試物(受試物含量與 Ames試驗相同)分別按1μL/g的魚體重注射于魚背肌,2次染毒時間間隔24h,在第2次染毒結束后6h,進行尾靜脈采血,制備血涂片,自然晾干,經甲醇固定后Giemsa染色20min.環磷酰胺(80mg/kg)作為陽性對照,每個劑量組從 5尾健康錦鯉中隨機抽取2尾,每尾魚制2張血涂片.每張片子計數2000個清晰完整、染色良好的紅細胞,顯微鏡下計數,計算微核千分率(‰).

微核判斷標準:微核位于紅細胞胞漿中,與主核完全分開,邊緣清晰光滑,染色與主核一致或略淺,大小為主核的1/20~1/3.

1.7 水源水中微囊藻毒素的DNA損傷檢測

常規方法從健康成年志愿者全血中分離淋巴細胞,PBS緩沖液制備5×106/mL的細胞懸液,臺盼藍測定細胞存活率.在裝有RPMI 1640培養基的離心管內分裝細胞懸液100μL/管,分別加入10μL 各濃度受試物(受試物含量與 Ames試驗相同),陽性對照組加10μL 5mmol/L重鉻酸鉀溶液使得最終濃度為 0.1mmol/L,另作陰性對照組和水源水組,37℃ 5% CO2染毒6h.彗星試驗采用2層凝膠法[11],染毒完畢用PBS液洗細胞2次,以防止毒物繼續影響,臺盼藍測定細胞存活率,進行彗星試驗檢測,經鋪片、堿性解旋、電泳、中和與固定后,40μL EB (20μg/mL)染色,熒光顯微鏡下觀察攝片,每張片子隨機拍攝100個細胞,以細胞尾部DNA百分比(%)、彗星尾長(μm)、尾矩和Olive尾距綜合反映細胞DNA損傷情況.

1.8 統計學分析

利用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理和分析,主要統計分析方法為Levene檢驗、方差分析、LSD-t檢驗、卡方檢驗.

2 結果

2.1 基于EPA模型的水源水健康風險度結果

101個縣級以上集中式飲用水源地水樣共檢出MC-LR(13處)、MC-RR(15處),主要分布于湖州、臺州和金華地區,最高檢出濃度下對應的個人年均致癌與非致癌風險如表1所示.MC-LR的個人非致癌年風險為4.80×10-9,未超過國際輻射防護委員會(ICRP)推薦的最大可接受風險 5.0× 10-5[12],MC-RR無相應參考劑量,其健康風險未予計算.

表1 基于EPA模型的有機污染物健康風險度Table 1 Health risk caused by organic pollutants in drinking water source based on EPA model

2.2 水源水中MC的致突變性作用

藻毒素水源水濃集物A、B,藻毒素稀釋水樣A、B及MC-LR純毒素各組致突變結果如表2、表 3所示,無論是否加入代謝活化系統(S9), TA97、TA98、TA100和TA102各菌株回變菌落數均高于空白對照組,且存在一定的劑量反應關系,但結果均未達到自發回變菌落數的2倍,依據Ames試驗判定標準,藻毒素濃集物、稀釋水樣及純毒素均未顯示出明顯致突變性.

非代謝活化條件下,濃集物A和水樣A多個劑量組TA97、TA98、TA100菌株,濃集物B和水樣B多個劑量組TA97、TA98、TA100和TA102菌株回變數高于同劑量純毒素,差異具有統計學意義(P<0.01;P<0.05).

代謝活化條件下,各菌株回變數較非代謝活化條件下有所上升,濃集物A多個劑量組TA98、TA100菌株回變數明顯高于同劑量純毒素,水樣A多個劑量組對TA100菌株回變數明顯高于同劑量純毒素,水樣 B和 B濃集物多個劑量組TA98、TA100和TA102菌株回變數明顯高于同劑量純毒素,差異具有統計學意義 (P<0.01; P<0.05).

表2 水源水中微囊藻毒素非代謝活化條件下的所致回變菌落數(個/皿)Table 2 The number of revertant colonies induced by microcystin without metabolic activation (CFU/dish)

表3 水源水中微囊藻毒素代謝活化條件下的所致回變菌落數(個/皿)Table 3 The number of revertant colonies induced by microcystin with metabolic activation (CFU/dish)

2.3 水源水中的MC與染色體損傷效應

水源水中微囊藻毒素對錦鯉外周血紅細胞微核率的影響如表4所示,水源水藻毒素濃集物、藻毒素稀釋水樣及 MC-LR純毒素均可在一定程度上誘導紅細胞產生微核.藻毒素濃集物、稀釋水樣及純毒素各組錦鯉外周血紅細胞微核率均高于陰性對照,純毒素最高劑量組(100.00μg/L)微核率達到 2.37‰±0.62‰,與對照組(0.75‰±0.64‰)相比,差異具有統計學意義(P<0.01),表明該劑量下可誘發染色體損傷.濃集物A和水樣A多組細胞微核發生率高于對照組,最高劑量下(100.00μg/L)微核率分別達到 2.50‰±1.29‰和3.37‰±1.11‰,與溶劑對照相比,差異具有統計學意義(P<0.01).濃集物B和水樣B各組微核率高于水源對照,濃集物 B最高劑量組微核率達到3.18‰±0.41‰,與溶劑對照相比,差異具有統計學意義(P<0.01).

2.4 水源水中MC引起的DNA損傷效應

水源水中MC對人外周血淋巴細胞DNA損傷結果如圖1、表5所示.染毒前后,對照組和染毒組細胞存活率均不低于 95%,且差異無統計學意義(P>0.05).圖 1A中陰性對照組細胞呈圓形,無彗尾現象,提示DNA鏈未發生明顯斷裂;從圖1B~圖1F可以看出各染毒組均出現明顯彗星樣拖尾,表明DNA鏈受損發生斷裂,且隨著染毒劑量的增加損傷逐漸加重,100.00μg/L組細胞DNA損傷最為嚴重,圖像表現為熒光信號變小,尾部長且尾部面積大(圖1F).

純毒素各組尾部DNA百分比、尾長、尾矩和 Olive尾矩均高于陰性對照組,最高劑量組DNA百分比為 30.13%±23.94%,尾長為(29.52± 23.70)μm,尾矩和 Olive尾矩分別達到 13.50± 18.07和8.23±10.06,與對照組間差異具有統計學意義(P<0.01),表明MC-LR可引起人外周血淋巴細胞DNA鏈斷裂,且DNA損傷各指標隨著染毒劑量的增加呈上升趨勢.

水源水藻毒素濃集物 A和濃集物 B各組DNA損傷指標均高于陰性對照組,差異具有統計學意義(P<0.01),存在一定的劑量反應關系,最高劑量組(100.00μg/L)尾部DNA百分比、尾長、尾矩和 Olive尾矩等各項指標接近陽性對照水平,表明各劑量組濃集物A均可引起細胞DNA損傷,高劑量染毒條件下損傷最為嚴重.

表4 水源水中微囊藻毒素對錦鯉紅細胞微核率的影響Table 4 Micronuclei induction in carp erythrocytes exposed to microcystin in drinking source water

圖1 MC-LR致人外周血淋巴細胞DNA損傷彗星圖像 (EB染色,×400)Fig.1 Comet picture of human lymphocytes exposed to MC-LR (×400)

表5 水源水中微囊藻毒素對人外周血淋巴細胞DNA損傷的影響Table 5 DNA damage in human peripheral blood lymphocytes exposed microcystin

稀釋水樣A中除0.01μg/L組外,各組DNA損傷指標均高于水源對照,差異具有統計學意義(P<0.01),存在一定的劑量反應關系.其中100.00μg/L組DNA百分比為(22.77±15.67)%,彗星尾長達到(23.88±14.53)μm,尾矩和 Olive尾矩分別為7.17±7.67和4.81±4.24,表明水樣A中的微囊藻毒素對人外周血淋巴細胞DNA鏈產生了損傷,且隨著染毒劑量的增加,DNA損傷程度呈現加重的趨勢.稀釋水樣 B 中 1.00,10.00, 100.00μg/L組DNA損傷指標均明顯高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.01),且具有一定的劑量反應關系.這表明水樣B中微囊藻毒素引起了淋巴細胞DNA鏈斷裂,具有DNA損傷能力.

3 討論

對浙江省 101個縣級以上飲用水源地水樣中的2種MC進行監測,MC-LR引起的非致癌風險達到4.80×10-8a-1,MC-RR無相關毒理學參數,健康風險未予計算,因此水源水中MC的實際風險高于計算值.太湖 MC-LR的濃度較低(0.01~ 0.43μg/L),未超過國家飲用水規范中 MC-LR低于1.0μg/L的限定標準,但藍藻暴發時期水中MC濃度迅速上升,可高達54.89μg/L[13].

本研究運用樹脂對水源水中的 MC進行濃集,同時以水源水為溶劑稀釋MC-LR純品,對天然水體中的不同濃度藻毒素可能存在的遺傳毒性進行了檢測,分析了可能存在的健康風險.結果顯示了水源水藻毒素濃集物、稀釋水樣和純毒素各組無論是否加入代謝活化系統,對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102各菌株均未呈現致突變能力,這與 Ding等[14]的研究結果一致.藻毒素濃集物、稀釋水樣與純毒素相比,多個劑量組回變菌落數高于純毒素組,猜測水源水濃集過程同時可能帶入一些有機物質,而水源水中除含有藻毒素以外,還可能含有一些其他生物活性成分,本身具有一定的致突變性,或者與藻毒素相互作用增強了致突變性,從而可能導致藻毒素濃集物、稀釋水樣與純毒素在菌株回變數上的差異.有研究顯示,各個季節的太湖水樣Ames試驗陽性,可誘導基因突變[15],而宋瑞霞等[16]從太湖藍藻水華中提取微囊藻毒素顯示可導致TA98菌株發生移碼突變,考慮可能是由于不同水體中藻群生物性狀的差異,MC構型的不同所致.

微核是細胞有絲分裂后期滯留于胞質中的染色體片段或染色單體,主要由于染色體斷裂、非整倍體化形成,是染色體損傷的標志之一,目前廣泛用于放射損傷和誘變劑檢測.有研究顯示,MC-LR可以誘發TK6細胞、小鼠骨髓細胞微核率上升[16-17],但是MC對淡水魚類的遺傳毒性的生態毒理學研究仍較少.本研究結果顯示高劑量組濃集物、水樣A和高劑量組的純毒素誘發淡水魚類紅細胞微核率增高,可致染色體損傷,對水生生物具有遺傳毒性效應.

目前對于MC是否具有DNA水平上的遺傳毒性還存在著較大的爭議.研究發現,1mg/L MC-LR可以誘導 20%的人外周血淋巴細胞DNA發生明顯損傷[18].而本研究中MC-LR純毒素、濃集物與水樣在彗星試驗中各項DNA損傷指標均有不同程度上升,顯示了較強的損傷作用,其損傷程度隨著染毒劑量增加而逐步加重,存在良好的劑量反應關系.目前MC-LR引起DNA損傷機制尚不十分明了,有學者認為 MC-LR導致DNA損傷并不是某個機制的單一作用的結果,氧化應激在藻毒素所致的DNA損傷中發揮重要作用,較短時間暴露就能檢測到 DNA鏈的斷裂[19-21].有研究者證明MC-LR可干擾DNA的堿基切除修復[22],這可能是藻毒素的致癌作用的機制之一,而其表現出的 DNA損傷作用是由早期凋亡引起的.研究發現caspase-3、p53、bcl-2和Bax在MC-LR誘導的細胞凋亡中可能具有重要作用[23-24].也有專家認為藻毒素可能并不能直接造成 DNA損傷,而是通過抑制其修復酶的活性所導致的損傷[21].

本研究發現,水源水濃集物及水源水中MC-LR的遺傳毒性與純毒素相比存在一定的差別,Ames試驗中水源水濃集物和2地水樣多個劑量組引起回變菌落數高于純的藻毒素組,彗星試驗中水源水濃集物、水源水樣中MC-LR與純毒素的 DNA損傷作用大小也具有一定的差異,考慮水源水中除藻毒素以外可能還存在其他的有機毒物,雖然濃度較低,也可能產生一定的遺傳毒性效應,仍需進一步深入研究.

4 結論

4.1 浙江省 101個縣級以上飲用水源水中MC-LR引起的非致癌風險達到4.80×10-9a-1,未超過ICRP推薦的最大可接受水平(5.0×10-5a-1).

4.2 在本研究條件下,水源水MC濃集物及MC稀釋水樣可誘導鯉魚紅細胞微核率上升,引發人外周血淋巴細胞 DNA損傷,具有一定的遺傳毒性,尚未觀察到具有致Ames試驗陽性的能力,對人體健康存在潛在威脅.

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