納米ZnO對斑馬魚胚胎抗氧化酶系統的影響

田文靜,白 偉,趙春祿,張智勇,崔俊安,何 瀟,馬宇輝,趙宇亮 (.青島科技大學環境與安全工

納米技術的迅猛發展使人造納米材料在消費品和工業產品中得到廣泛使用,但其特殊的物理化學性質可能會對人類健康和生態環境造成負面影響[1].已有文獻表明納米ZnO具有明顯的生態毒性[2-4],但其毒作用機理目前仍不清楚.

氧化損傷被認為是納米材料毒性的作用機制之一,但目前研究主要利用離體細胞或成年動物[5].然而,離體細胞培養條件與體內環境存在很大差異,體外細胞實驗結果在外推到整體動物時存在一定的局限性;胚胎或幼體在發育階段許多組織和器官尚未發育完全,沒有形成完善的對外界刺激的響應機制(如免疫功能等),因此其對污染物的響應機制可能不同于成年動物.基于以上考慮,本研究以斑馬魚胚胎為模式生物,通過測定胚胎中主要抗氧化物含量和酶活性,研究納米ZnO暴露對其抗氧化系統的影響,探討ZnO抑制斑馬魚胚胎孵化的作用機理.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年斑馬魚由北京大學生命科學學院遺傳發育中心斑馬魚實驗室提供,在本實驗室循環養殖系統中馴養3個月后收集魚卵.循環養殖水根據Brand等[6]的方法配制:每1000L去離子水中加入75g碳酸氫鈉,18g海鹽和8.4g硫酸鈣,水溫(28±1)℃,pH值為7.2,總硬度為62mg/L(以CaCO3計),電導率為485μS.光/暗周期為14h:10h.斑馬魚每日喂食2次人工孵化的鹵蟲幼體和1次蝦片(購于廣東揭陽市越群海洋生物研究開發公司).

1.2 試劑與儀器

試劑:納米 ZnO(30nm,純度＞99.9%)購自杭州萬景新材料有限公司.納米ZnO的物理、化學性質,包括粒徑、溶解性等在先前的研究中已進行了詳細表征[4].蛋白質測試試劑盒(BCA)購自碧云天生物技術研究所,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.其余化學試劑均為國產分析純試劑.

儀器:KQ-50B型超聲波清洗器(南京昕航科學儀器有限公司),MGC-250智能型光照培養箱(上海一恒科技有限公司),低溫冰箱(Forma- 86C, USA),pH計(PB-10,Sartorius,Germany),高速冷凍離心機(Sigma3k15,Germany),酶標儀(SpectraMaxM2, USA),超聲波細胞破碎儀(VCΧ105, USA).

1.3 納米ZnO懸浮液的制備

試驗用水均為充氧飽和的標準胚胎培養液(E3)[6]:5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.33mmol/ LCaCl2和 0.33mmol/LMgSO4,不含亞甲基藍,并用NaHCO3溶液調節pH值至7.2.納米ZnO儲備液(100mg/L)的制備:直接將納米 ZnO顆粒加入一定體積的E3培養液中(不使用助溶劑),在冰水浴中超聲分散(50W,40kHz,30min).不同濃度納米ZnO 懸浮液用 E3培養液逐級稀釋制備:0,1, 5,10,50mg/L.考慮到納米材料在水中極易團聚沉淀,納米 ZnO懸浮液均為當天暴露前新鮮配制,使用前超聲5min.

1.4 胚胎毒性實驗

胚胎毒性實驗根據 Best等[7]的方法稍加修改進行.即將 500 個正常受精卵(囊胚期,2.5～3h)加入到含800mL不同濃度納米ZnO懸浮液的燒杯中,置于光照培養箱中,溫度為(28±1)℃,光/暗周期為 14h:10h,處理 72h后收集胚胎和幼魚.處理過程中及時挑出凝結卵,防止其對正常卵產生影響.每個處理重復5次.同時進行對應濃度Zn2+處理對比實驗,步驟同納米ZnO.

1.5 樣品預處理和抗氧化指標測定

處理結束后,用 28℃去離子水清洗受試斑馬魚胚胎,去除表面附著的納米ZnO和Zn2+,將胚胎和幼魚置于離心管中,去除殘余水分,稱量后加入預冷勻漿介質(0.01mol/LTris-HCl,0.0001mol/ LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%NaCl, pH=7.4),在冰水浴中勻漿(8s/2s/60%/2min),離心勻漿液(4℃ ,13000r/min,10min),取上清液置于-80℃冰箱內保存待用.蛋白含量和抗氧化指標(GSH、SOD、CAT和MDA)測定均參考相應試劑盒說明書進行.

1.6 數據分析

實驗數據表示為平均值±標準差(Mean±SD),采用 SPSS15軟件進行單因素方差分析(onewayANOVA),處理組與對照組間差異顯著性檢驗采用Dunnet’t法,對應濃度納米ZnO和Zn2+處理組間差異顯著性檢驗采用LSD法、Turkey法. P＜0.05表示差異顯著.

2 結果

2.1 GSH變化

圖1 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎GSH含量的影響Fig.1 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on GSH contents of zebrafish embryos

由圖1可見,納米ZnO處理24h后斑馬魚胚胎GSH含量低于對照組, 50mg/L納米ZnO處理后斑馬魚胚胎GSH含量顯著降低; Zn2+處理24h后,斑馬魚胚胎 GSH含量低于對照組,但無顯著性差異.50mg/L納米ZnO處理48h后,斑馬魚胚胎GSH含量顯著降低;5.3mg/L Zn2+處理48h后,斑馬魚胚胎GSH含量顯著降低.納米ZnO處理72h后,斑馬魚胚胎無顯著差異;Zn2+處理72h后,斑馬魚胚胎GSH含量低于對照組,5.3mg/L Zn2+處理組 GSH含量顯著降低.在相同處理時間內,對應濃度納米ZnO和Zn2+處理組間斑馬魚胚胎GSH含量無顯著性差異.

2.2 SOD活性變化

由圖2可見,處理24h后,除1mg/L外,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎SOD活性均顯著低于對照組;Zn2+處理組斑馬魚胚胎SOD活性隨Zn2+濃度增大而逐漸降低,3.6,5.3mg/L處理組SOD活性顯著降低. 處理48h后,納米ZnO和Zn2+處理組斑馬魚胚胎SOD活性表現出逐漸降低趨勢,但均無顯著性差異.處理72h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎 SOD活性隨納米 ZnO濃度增大而降低,10,50mg/L處理組斑馬魚胚胎SOD活性顯著低于對照組; Zn2+處理組斑馬魚胚胎 SOD活性表現出逐漸降低趨勢,但與對照組無顯著性差異.對比實驗結果表明,在相同處理時間內,對應濃度納米ZnO和Zn2+處理組間斑馬魚胚胎SOD活性無顯著性差異.

圖2 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎SOD活性的影響Fig.2 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on SOD activities of zebrafish embryos

2.3 CAT活性變化

由圖3可見,處理24h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎CAT活性逐漸降低,均顯著低于對照組; Zn2+處理組斑馬魚胚胎 CAT活性逐漸降低,3.6, 5.3mg/L處理組斑馬魚胚胎 CAT活性顯著低于對照組.處理48h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎CAT活性低于對照組,其中5,10,50mg/L處理組CAT活性顯著低于對照組;Zn2+處理組CAT活性逐漸降低,3.6,5.3mg/L處理組CAT活性顯著低于對照組.處理72h后,納米ZnO和Zn2+處理組斑馬魚胚胎CAT活性均低于對照組,但無顯著性差異.實驗結果表明,1mg/L納米ZnO處理組斑馬魚胚胎CAT活性顯著低于0.6mg/L Zn2+處理組.

圖3 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎CAT活性的影響.Fig.3 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on CAT activities of zebrafish embryos

2.4 MDA含量變化

由圖4可見,處理24h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎MDA含量逐漸升高,10,50mg/L處理組斑馬魚胚胎 MDA含量顯著高于對照組;Zn2+處理組斑馬魚胚胎 MDA含量均高于對照組, 6.3mg/L處理組MDA含量顯著升高.處理48 h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎MDA含量逐漸增大,均顯著高于對照組,5.3mg/L Zn2+處理組斑馬魚胚胎 MDA含量顯著高于對照組;對比實驗發現,1,5,10mg/L納米 ZnO處理組斑馬魚胚胎MDA含量均顯著高于對應濃度 Zn2+處理組(0.6,2.2,3.6mg/L).處理72h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎 MDA含量逐漸增大,均顯著高于對照組,Zn2+處理組斑馬魚胚胎 MDA含量與對照組相比無顯著性差異;對比實驗結果表明,在處理48,72h后,10,50mg/L納米ZnO處理組斑馬魚胚胎 MDA含量均顯著高于對應濃度 Zn2+處理組(3.6和5.3mg/L).

圖4 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎MDA含量的影響.Fig.4 Effects of Nano-ZnO/Zn2+ on MDA contents of zebrafish embryos

3 討論

本課題組[5]發現,50,100mg/L納米ZnO導致斑馬魚胚胎死亡,1～25mg/L納米ZnO明顯抑制斑馬魚胚胎孵化,并導致幼魚體長變短和產生尾部畸形.對比實驗表明 Zn2+的釋放不能完全解釋納米ZnO所致斑馬魚胚胎毒性.本研究試圖從氧化應激角度探討納米ZnO毒作用機理.氧化應激是機體在遭受各種有害刺激時,體內高活性分子如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)產生過多,超過機體防御系統的清除能力,氧化系統和抗氧化系統失衡,從而導致機體組織損傷,如脂質過氧化、酶失活、DNA斷裂等[8].

GSH是一種具有特殊生物學功能的氨基酸衍生物,屬于含有巰基的小分子肽類物質.在外界刺激下,GSH會被誘導,清除體內產生的自由基,如果 GSH耗竭則導致機體產生中毒效應. Usenko等[9]發現在處理過程中加入谷胱甘肽前體(N-乙酰半胱氨酸 NAC)能夠降低富勒烯(C60)單獨處理引起的斑馬魚胚胎死亡率和心包囊腫現象,而加入谷胱甘肽合成抑制劑(丁硫氨酸硫酸亞胺BSO和馬來酸二乙酯DEM)卻能夠增大斑馬魚胚胎對 C60處理的敏感性.Zhu等[10]發現直接加入GSH能夠減輕C60處理引起的斑馬魚胚胎發育毒性,認為 C60通過氧化應激機制發揮其毒作用.本研究發現,納米ZnO處理24h、48h和72h后,處理組胚胎GSH含量均發生不同程度降低現象,這一現象可能是由于納米ZnO處理導致受試胚胎體內自由基增多,從而消耗體內GSH,進而導致其含量降低.

SOD是一種清除超氧陰離子(O2-·)的特異性酶,能夠與 O2-·作用發生歧化反應,將其分解為H2O2和 O2,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用.Sharma等[11]研究了納米 ZnO對人上皮細胞系(A431)的影響,發現納米ZnO能夠消耗GSH,降低CAT活性和SOD活性,引起氧化損傷,并進而引起A431細胞的基因毒性.朱小山等[12]發現長期低劑量富勒烯(C60)處理能夠引起鯽魚的氧化傷害,顯著降低鯽魚腦、肝臟、鰓組織中GSH含量,降低肝臟組織中CAT和SOD活性.本研究結果表明納米ZnO處理導致斑馬魚胚胎 SOD活性隨處理濃度增加呈現出降低趨勢,這些現象表明納米ZnO處理導致受試胚胎體內O2-增多,超出了SOD酶清除能力,反過來抑制了SOD活性.

CAT是過氧化物酶體的標志酶,約占過氧化物酶體酶總量的40%,是一種酶類清除劑,可促使體內H2O2分解為分子氧和水,使細胞免受H2O2的毒害,是生物防御體系的關鍵酶之一.Turkez等[13]發現納米TiO2能夠導致人全血谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)、CAT、SOD活性降低,誘發氧化應激并導致DNA損傷.Kalper等[14]發現氫化C60(hydrogenated C60, C60-Hx)、羥基化C60(hydroxylated C60,C60-OH)和納米TiO2能夠增大CAT活性,但攪拌制備和THF制備的nC60對CAT活性沒有影響,認為氧化應激標志物(如CAT, GST等)可用來預測納米材料的潛在毒性.Wang 等[15]發現[Gd@C82(OH)22]n能夠降低小鼠肝CAT和SOD活性.本研究中納米ZnO處理24h和48h能夠降低斑馬魚CAT活性,表明納米ZnO對CAT活性具有明顯的抑制作用.

MDA是生物膜中多種不飽和脂肪酸在氧自由基攻擊下形成的脂質過氧化產物，其含量變化可反映出機體損傷的程度.SOD和GSH-Px活性的降低,可導致機體脂質過氧化物產生,MDA含量增大. Wang等[16]發現硅納米粒子(20和50 nm)能夠誘導人胚胎腎細胞產生ROS,降低胞內GSH含量,引起人胚胎腎細胞MDA含量增大,產生細胞毒性.Sayes等[17]發現C60處理48 h可導致人真皮纖維原細胞(HDF)、人肝癌細胞(HepG2)、人神經膠質細胞(NHA)MDA含量增大,細胞膜完整性受損,GSH含量增大.本研究中納米ZnO處理24h、48h和 72h,均導致受試斑馬魚胚胎 MDA含量增大,納米ZnO處理48h和72h后導致MDA含量均大于相應濃度Zn2+處理組,表明納米ZnO處理導致胚胎體內細胞膜損傷, 氧化損傷程度大于相應濃度Zn2+處理組.

4 結論

4.1 納米ZnO對斑馬魚胚胎抗氧化指標均產生了不同程度的影響,表明納米ZnO對斑馬魚胚胎產生氧化損傷,進而引起斑馬魚胚胎生理機能改變,導致不能成功孵化.

4.2 對比實驗證明溶解釋放的 Zn對納米 ZnO毒性有一定的貢獻,是其毒作用機制之一.

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