不同原料配比對醬油成曲抗氧化活性的影響*

鄒陽，崔春，趙謀明

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

醬油主要采用大豆、豆粕、小麥、麩皮、面粉等原料，經過微生物發酵以及酶促和非酶促化學反應而成，是亞洲飲食中不可缺少的調味品，目前也逐步為西方國家廣泛接受［1］。研究表明，醬油不僅起著重要的調味作用，還含有許多生理活性物質，具有多種保健功能，其中以抗氧化、抗癌作用最引人注目，醬油的抗氧化性也是當今研究的熱點［2－4］。

制曲是指將曲霉接種到經過預處理的原料上，并提供適宜的條件使曲霉菌等有益微生物充分發育繁殖，大量分泌醬油釀造所需要的各種酶類。制曲是醬油生產的關鍵環節，成曲質量的好壞對醬油的品質有決定性的影響。有研究報道［5］，醬油中大量的抗氧化物質主要是在醬油固體制曲的過程中產生的，而液體發酵階段是抗氧化物質從固體中逐漸釋放到液體中的過程，因而開展對醬油制曲的氧化性的研究是十分必要的。Lin［6］等報道了大豆經過米曲霉等發酵后其DPPH自由基清除能力、金屬鐵離子螯合能力、總酚含量都有明顯增加。除大豆外，豆粕、小麥、麩皮、面粉等也是醬油制曲的重要原料，但對這些原料混合制曲的抗氧化性評價鮮有報道。

本研究將大豆、面粉、麩皮、豆粕、小麥粉按生產中常見的配比復合發酵，并評價醬油成曲的不同酶系的活力及抗氧化性能，為高抗氧化性能的醬油的生產提供理論和方法的指導。

1 材料與方法

1.1 原料

大豆、面粉、麩皮、小麥、豆粕:市售。

菌種:曲精(滬釀3.042孢子粉)，符合質量標準，孢子發芽率≥80%，孢子數≥100億/g(干基)，水分≤10%。

試劑∶均為分析級。

1.2 實驗儀器與設備

EL3002－電子天平，UV-2100紫外可見分光光度計，ZJP-A1230恒溫恒濕培養箱，LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，HH-8恒溫水浴鍋，WH-3微型旋渦混合儀，旋轉蒸發器。

1.3 實驗方法

1.3.1 制曲流程

醬油制作主要采用植物蛋白含量高的大豆和豆粕為蛋白原料，小麥、麩皮、玉米等作為淀粉原料。目前醬油生產中使用得最多的原料是大豆、豆粕、小麥、麩皮，我國傳統發酵醬油使用的配比為大豆與小麥質量比為100∶40和100∶50，豆粕與麩皮質量比為100∶10和60∶40。日本醬油制曲采用的原料配比一般為:m(脫脂大豆):m(小麥)為50∶50 或60∶40［7］。本文采用如表1的原料配比。

表1 原料配比質量分數 %

大豆清洗，浸泡5～6 h，以1∶1質量比潤水，豆粕于121℃高壓蒸煮12 min，冷卻至40℃左右，按表1比例分別與面粉、小麥粉、麩皮混合拌勻，接種醬油曲精，平鋪在各曲盤，按文獻［8］在恒溫恒濕培養箱培養44h。培養過程中注意及時翻曲，以調節溫度和濕度，控制品溫不超過38℃。44 h后取出醬油成曲，冷藏備用。

1.3.2 福林酚法測定中性及酸性蛋白酶活力［9］

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活力測定［10］

1.3.4 淀粉酶活力測定［11］

1.3.5 提取溶劑的選擇

以索氏抽提法［12］對醬油成曲粉脫脂。稱取5份均為4.000 g的脫脂曲粉，分別加入80 mL蒸餾水、80%乙醇、80%丙酮、17%鹽水、80%甲醇，振蕩提取1 h，取出真空抽濾，所得濾液進行旋轉蒸發濃縮至干，稱重用于計算提取率，再將提取物溶解定容至50 mL測定抗氧化性。

1.3.6 DPPH自由基清除能力測定［13］

將曲粉溶解，精確吸取稀釋液2 mL，與2 mL濃度2×10－4mol/L的DPPH·溶液混合均勻后避光放置30 min，測定517 nm處的吸光度值(A樣品);測定2 mL樣品稀釋液加2 mL乙醇在517 nm處的吸光值A對照以及2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液在517 nm處的吸光值A空白。

1.3.7 ABTS+清除能力測定

ABTS+儲備液制備:以去離子水將 ABTS+和K2S2O8分別溶解并混合，使其終濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫、避光條件下靜置12～16 h，該儲備液可穩定3～4 d。測定時，將ABTS+儲備液以磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)稀釋，使其吸光度達到0.700±0.020(734 nm波長下)，形成ABTS+測定液。吸取4.0 mL ABTS+測定液，加人40 μL Trolox或樣品稀釋液，準確振蕩30 s，測定避光反應6 min后734 nm處的吸光值。計算Trolox當量，即 TEAC 值［14］。

1.3.8 還原能力測定

取2 mL樣品液加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.6)及2.5 mL1%鐵氰化鉀，50℃保溫20 min，再加2.5 mL10%三氯乙酸混勻，加2.5 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%三氯化鐵，于700 nm波長比色［15］。以Trolox做標準曲線，計算Trolox當量。

1.3.9 總酚含量測定

精確稱取0.005 g沒食子酸標準樣品，蒸餾水溶解并定容至50 mL。該標準液濃度為0.1 mg/mL。準確量取上述標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于20 mL刻度試管中，各加6 mL水，搖勻，再加2.5 mL Folin-Denis試劑，充分搖勻。3 min之后，加入1mL 20%Na2CO3溶液，補足至10 mL，充分混勻，75℃水浴10 min，于760 nm處測吸光值，建立標準曲線［16］。取100 μL樣品液同標準曲線的做法測定總酚含量，以100 μL蒸餾水代替樣品液，作為空白對照［17］。

2 結果與分析

2.1 醬油成曲的中性和酸性蛋白酶活力

成曲的好壞直接影響后續發酵的進行，醬油發酵前期主要是中性蛋白酶起作用，把原料中蛋白質分解成多肽和氨基酸，產生醬油理化指標成分全氮、氨基酸態氮。醬油發酵后期由于pH值下降，因此酸性蛋白酶起了主要的作用。有研究表明［18］，原料中蛋白質經蛋白酶降解作用后產生的多肽類和氨基酸與還原糖作用產生的褐色色素類物質具有抗氧化作用。

圖1 四種醬油成曲的蛋白酶活力

由圖1可知，中性蛋白酶活力強弱順序為:成曲2號＞成曲4號＞成曲1號＞成曲3號;酸性蛋白酶活力也呈現出相似的趨勢。2號、1號和4號都是以大豆為原料發酵而成，而3號是由豆粕發酵而成，總體來看，大豆制作的醬油成曲的中性和酸性蛋白酶活力比豆粕制作的醬油成曲高。豆粕為大小不一，形狀不規則的扁平顆粒，與小麥粉混合后空隙小，在制曲過程中通風情況不好，影響了曲的生長情況，生長情況不如大豆的好，因此以大豆制得的成曲的蛋白酶活性高于豆粕。成曲2號的中性和酸性蛋白酶活力是最高的。從原料來看，2號采用了麩皮作為輔料。有研究表明［19］，麩皮富含淀粉和蛋白質，多種維生素，鈣、鐵等無機物，且質地疏松，表面積大，有利于米曲霉生長和產酶，因此添加麩皮制曲會使蛋白酶活力提高。

2.2 醬油曲的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力

研究表明［20］，大豆異黃酮具有很好的抗氧化作用，而游離型異黃酮比糖苷型異黃酮的抗氧化作用更強。大豆原料中的異黃酮主要以糖苷型異黃酮形式存在，在發酵過程中微生物能夠分泌β-葡萄糖苷酶，糖苷型大豆異黃酮在β-葡萄糖苷酶的作用下部分轉化為游離型大豆異黃酮，使抗氧化作用明顯提高。淀粉酶將淀粉水解成還原糖，與氨基酸作用可以產生美拉德反應生成具有良好的抗氧化活性的褐色物質，而且淀粉酶與β-葡萄糖苷酶有利于原料中多酚物質的釋放［21］，對醬油的抗氧化作用也起了重要作用。

溶劑的極性對成曲中的抗氧化活性物質的提取具有重要的影響，而不同的抗氧化活性物質對不同的抗氧化力評價方法的響應也不同［23］，因此，明確提取溶劑對成曲中的抗氧化活性物質的提取能力與選擇性是評價成曲抗氧化力的前提和基礎。本實驗采用5種溶劑來提取(表3)，以確定最適合的提取溶劑。

表3 不同溶劑提取物清除DPPH和ABTS+自由基能力

表2 四種醬油成曲的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力

由表2可知，4種醬油成曲的淀粉酶和β-葡萄糖苷酶活力的強弱為:成曲3號＞成曲4號＞成曲2號＞成曲1號。一般來說，醬油曲的原料組成與大部分微生物培養基一樣，由碳源和氮源組成。大豆與豆粕蛋白質含量豐富，適合作為米曲霉的氮源，而小麥粉、面粉被米曲霉分泌的淀粉酶水解，提供其生長必須的碳源。在一定范圍內，提供的碳源越多，米曲霉的生長越旺盛，分泌的淀粉酶和β-葡萄糖苷酶也更多。3號與4號曲的原料比1號和2號曲的原料能夠提供更高的淀粉含量，適合米曲霉的生長，因此具有更高的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力。研究表明［22］，麩皮為曲霉發酵產酶的最佳碳源，可能與麩皮的組成成分有關，即麩皮中易利用的糖類含量低，不致產生分解代謝產物阻遏，而且麩皮中含有一定量的有機氮，可以滿足微生物對有機氮的生長需要，因此成曲2號的淀粉酶及β-葡萄糖苷酶活力比1號高。

2.3 提取溶劑的確定

由表3可知，醬油成曲丙酮溶液提取物的抗氧化效果最好，提取物干重僅19 mg/mL，而DPPH清除率達到56.19%，TEAC值也最高達到68.81(μmol/g)，故選擇丙酮作為提取溶劑。

2.4 四種醬油成曲的抗氧化性評價

2.4.1 清除DPPH及ABTS+自由基能力

由表4可知，成曲清除DPPH的能力強弱為:2號＞1號＞4號＞3號。4種成曲在經過原料發酵后其清除DPPH能力提高，清除ABTS+的能力也有明顯增加，說明在制曲的過程中生成了新的抗氧化物質。大豆發酵的1號、2號、4號成曲其清除DPPH自由基的能力高于豆粕發酵的3號成曲。研究表明，大豆中含有異黃酮，多肽，大豆皂苷等具有抗氧化活性的生理活性物質［24］，而豆粕是采取有機溶劑對大豆脫脂而成，而異黃酮可溶于有機溶劑中，因此在大豆加工成豆粕的過程中，大豆中的異黃酮等可能有一部分溶于有機溶劑中而流失，因此由大豆發酵的成曲的抗氧化性高于豆粕發酵的成曲。與1號成曲相比，以麩皮替換部分面粉的2號成曲的DPPH清除能力稍高，可見添加麩皮有利于提高清除DPPH自由基的能力，這也在相關研究中有證明［25］。

表4 四種醬油成曲及原料清除DPPH及ABTS+自由基能力

在清除ABTS自由基方面，清除ABTS+自由基能 力強弱為:1號＞2號＞4號＞3號。清除DPPH和ABTS+自由基能力的結果基本一致。1號、2號成曲清除ABTS+的能力較4號高，可能是因為1號、2號使用了較高的大豆與碳源比(4∶1)來發酵，而4號的大豆與小麥粉質量比為1∶1。由此可見，大豆的含量對成曲的抗氧化能力起了重要作用。4號成曲的ABTS自由基清除能力較未發酵的原料提高達6倍，可能是由于4號成曲的β-葡萄糖苷酶活力較高，大豆異黃酮苷被β-葡萄糖苷酶水解成為異黃酮苷元，異黃酮苷元具有更高的抗氧化性，使得成曲的抗氧化活性增加［20］。

2.4.2 還原能力

由表5可知，成曲的還原能力的強弱為:1號＞2號＞4號＞3號。原料的還原能力相當，經過發酵制曲后，成曲的還原能力有了明顯的提升，1號、2號、4號成曲原料中都使用了大豆，3號成曲原料使用了豆粕，說明大豆發酵而成的成曲的還原能力強于豆粕發酵而成的成曲。此外，1號和2號的大豆與小麥粉的比例分別為4∶1與4∶0.8，4號的大豆與小麥粉的比例為1∶1，也印證了提高原料大豆比例對成曲還原能力具有正向的影響。2號添加了麩皮作為輔料，其還原能力相對于1號并沒有增加，說明添加麩皮對還原能力沒有影響。

表5 四種醬油原料及成曲的還原能力

2.4.3 總酚含量測定

圖2 四種醬油成曲及原料的總酚含量

由圖2可以看出，成曲的總酚含量與抗氧化能力順序一致，即由大豆作為氮源發酵的成曲的總酚含量高于由豆粕作為氮源發酵的成曲。此外，原料經過發酵成為成曲后其總酚含量有明顯提高，研究表明［21］，通過制曲發酵后的大豆的總酚含量有很大提高，且淀粉酶與β-葡萄糖苷酶對總酚的提高都有作用，β-葡萄糖苷酶的作用較大。成曲1號的總酚含量相對于原料提高了3.64倍，成曲2號相對于原料提高了4倍。4號相對于原料總酚含量提高了5.5倍，在4種成曲中總酚含量提高得最多，可能是因為β-葡萄糖苷酶活力較高，有研究表明［21］，β-葡萄糖苷酶有利于酚類物質的釋放，使得總酚含量增加。

3 結論

(1)不同原料制作的醬油成曲的抗氧化活性有明顯差異，總體上看，以大豆為原料發酵的成曲抗氧化性比豆粕發酵的成曲的抗氧化性高。

(2)原料通過發酵制曲后，成曲相對與原料其清除DPPH自由基及ABTS+自由基的能力、還原能力、總酚含量都有數倍的提高。從本實驗的結果來看，提高大豆在制曲原料中的比例，以及使用小麥粉作為米曲霉生長的碳源，可以大大提高醬油成曲的抗氧化性，有利于制備抗氧化性更好的醬油。因此適當的原料配比對制備抗氧化性更好的成曲也起了重要作用，后續可圍繞優化原料配比展開。

(2)蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的活力與醬油成曲的抗氧化性有一定的關系，但蛋白酶與淀粉酶的酶活力與抗氧化性的具體關系有待于進一步研究。

［1］ 呂東津，宋小焱，梁姚順.醬油中的生理活性物質及其營養保健作用［J］.中國釀造，2003(11):31－33.

［2］ Gapsoon Moon，Minja Lee，Youngsun Lee，et al.Main component of soy sauce representing antioxidative activity［J］.International Congress Series，2002，(1245):509 －510.

［3］ Shigehiro Kataoka.Functional effects of Japanese style fermented soy sauce(shoyu)and its components［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering ，2005，100(3):227 －234.

［4］ Lee Hua Long，Daniel Chua Thiam Kwee，Barry Halliwell.The antioxidant activities of seasonings used in Asian cooking［J］.Free Radical Research，2000，32(2):181 －186.

［5］ 曾小波，宋小焱，朱新貴，等.高鹽稀態法釀制醬油的抗氧化研究［J］.中國釀造，2009(1):131－133.

［6］ Lin Chia-Hung，Wei Yi-Tien，Chou Cheng-Chun.Enhanced antioxidative activity of soybean koji prepared with various filamentous fungi［J］.Food Microbiology，2006:628－633.

［7］ 傅鴻運.日本醬油的種類及工藝簡介［J］.中國調味品，1998，10(10):8－11.

［8］ 翟瑋瑋.醬油多菌種制曲工藝條件研究［J］.中國釀造，2005(10):37－39.

［9］ SB/T 10317－1999.蛋白酶活力測定法［S］.

［10］ Dyah Hesti Wardhani，Jose Antonio Vazquez，Severino S Pandiella.Mathematical modeling of the development of antioxidant activity in soybeans fermented with Aspergillus oryzae and Aspergillus awamori in the solid state［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008.

［11］ 趙德清，張景紅，荏亞青，等.空白值的選擇對糖化酶活力測定結果的影響［J］.飼料工業，1999，20(11):31－32.

［12］ 無錫輕工業學院，天津輕工業學院.食品分析［M］.北京:中國輕工業出版社，1990:120.

［13］ 孫麗萍，王大仟，張智武.11種天然植物提取物對DPPH自由基的清除作用［J］.食品科學，2009，30(1):45－47.

［14］ 李瑩，劉敏，崔春，等.醬油抗氧化能力評價及聚類分析［J］.食品發酵與工業，2008，34(1):14－19.

［15］ OyaizuM.Studies on products of browning reactions:Antioxida-tive activities of products of browning reaction prepared from glu-cosamine［J］.Japanese Journal of Nutrition，1986，44:307 －315.

［16］ 劉碩謙，劉仲華，黃建安.紫外分光光度法檢測水皂角總多酚的含量［J］.食品工業科技，2003，24(6):76－77.

［17］ 張春江，呂飛杰，臺建祥，等.，檳榔果及其制品中總酚和單寧含量的測定［J］.食品研究與開發，2008，29(6):119－121.

［18］ 馮麗娟，立群.醬油中營養活性物質研究進展［J］.中國調味品，2008，2(2):22－25.

［19］ Kaustav Aikat，Bimal Chandra Bhattacharyya.Protease extraction in solid state fermentation of wheat bran by a local strain of Rhizopus oryzae and growth studies by the soft geltechnique［J］.Process Biochemistry，2000(35):907–914.

［20］ Gilmi，Tomas-barberanfa，Hess-pierceb，etal.Antioxidantcapacities，phenolic，compounds，carotenoids，and vitamin C contents of nectarine，peach，and plum cultivars from California［J］.Journal of A griculture and Food Chemistry，2002，50(17):4 976 －4 982.

［21］ Lin Chia-Hung，Wei Yi-Tien，Chou Cheng-Chun.Enhanced antioxidative activity of soybean koji prepared with various filamentous fungi［J］.Food Microbiology，2006(23):628－633.

［22］ 潘利華，羅建平，羅水忠.同步輻射對黑曲霉β-葡萄糖苷酶產生條件及酶學性質的影響［J］.食品科學，2008，29(5):245－249.

［23］ Zhou Kequan，Yu Liangli.Effects of extraction solvent on wheat bran antioxidantactivity estimation［J］.Swiss Society of Food Science and Technology，2004，37:717 －721.

［24］ 唐傳核，彭志英.淺析大豆發酵食品的功能性成分［J］.中國釀造，2000(5):8－10.

［25］ 張莉，李志西.小麥麩皮對不同原料食醋抗氧化性的影響［J］.麥類作物學報，2009，29(5):915－918.