用神經網絡技術確定枇杷葉中熊果酸提取時間*

孫益民，焦容容，孫若瓊，張繼紅

1(安徽省功能性分子固體重點實驗室，安徽蕪湖，241000) 2(安徽師范大學化學與材料科學學院，安徽蕪湖，241000)3(安徽師范大學生命科學學院，安徽蕪湖，241000) 4(安徽師范大學環境科學學院，安徽蕪湖，241000)5(安徽省天然產物超臨界提取工程技術研究中心，安徽蕪湖，241007)

熊果酸(ursolic acid)是枇杷葉的有效成分之一，又名烏蘇酸、烏索酸，是多種植物的功能成分，具有抗炎抗菌、抗肝損傷［1－2］、抗氧化［3］、降血糖、降血脂、止咳等多種藥理活性［4］。近年來又發現熊果酸是很好的免疫增強劑［5］，具有較顯著的免疫和抗致癌作用。同時，熊果酸及其衍物還對病毒具有抑制活性，可望成為低毒、有效的新型抗癌和抗愛滋病毒藥物［6］。日本專利顯示熊果酸在抗癌保健食品、飲料和護發素、頭發生長劑等方面也有一定的應用［7］。可見，熊果酸有著廣闊的應用前景和十分重要的開發利用價值。

目前，對熊果酸提取多采用溶劑提取法。其特點是操作簡單，成本低廉。作者曾對超聲波輔助提取熊果酸進行較為系統的研究，運用均勻設計法安排試驗［8－9］，以高效液相色譜測定熊果酸的含量，以提取率為試驗指標，研究了乙醇體積分數、提取時間、提取次數、液固比及粒子大小5個因素對提取效果的影響。本文針對提取時間的影響進行了重點研究。

均勻設計可以安排多因素多水平試驗，均勻試驗成功關鍵在于科學合理地建立試驗因素與試驗指標間的定量關系，對實驗體系進行描述，從而進行工藝優化［10］。本文應用人工神經網絡技術挖掘試驗信息，并進行仿真指導驗證試驗，最終獲得了提取熊果酸的優化工藝，為工業化生產提供可靠參考信息。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

枇杷葉采自安徽蕪湖，經鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.的葉。無水乙醇(AR)，石油醚(AR、沸點60～90℃):國藥集團化學試劑有限公司;NaOH(AR):汕頭市西隴化工廠有限公司;熊果酸標準品:安徽蕪湖甙爾塔醫藥科技有限公司。

FA1204電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司;WG-43電熱鼓風干燥機，天津市泰斯特儀器有限公司;WF-111型高速中藥粉碎機，江陰市新友機械制造有限公司;TG328B分析天平，上海良平儀器儀表有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀，上海振捷實驗設備有限公司;CQ-150超聲波清洗機，上海躍進醫用光學器械廠;美國Mode12000半制備色譜儀(配有Lab Alliance model 500可變波長紫外檢測器和Lab Alliance HPLC Workstation)，美國Science System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 用超聲波法提取枇杷葉中熊果酸

將枇杷葉洗凈、去毛后放在干燥箱中烘干，冷卻至室溫后經粉碎機粉碎，經過分樣篩后備用。

稱取一定量的枇杷葉粉，超聲提取，趁熱過濾，濾液經旋轉蒸發濃縮后，以石油醚萃取近無色，萃余物配成無水乙醇溶液，加入適量的稀NaOH溶液，調節pH值至10～11，靜置。再將所得濾液中加入適量稀HCl，調節pH值至2～3。然后加入一定量蒸餾水，離心分離，干燥即得熊果酸粗品。

1.2.2 高效液相色譜測定所得粗品中熊果酸的含量

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱為Column型C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為 V(甲醇)∶V(水)=97∶3;檢測波長:215 nm;流速0.8 mL/min;柱溫13℃。

1.2.2.2 標準曲線的繪制

精密稱取熊果酸標準品5.3 mg置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，得到530 μg/mL的標準品溶液。再依次稀釋得 106、21.2、10.6、5.3 μg/mL 熊果酸對照品溶液。分別準確吸取熊果酸對照品溶液，在1.2.2.1色譜條件下進樣20 μL進行測定。其峰面積和濃度呈線性相關。回歸方程為Y=6 799+4 928X，r=0.999 999。

式中:Y為峰面積，X為濃度，r為相關因數。

說明當熊果酸進樣量在5.3～106 μg/mL時，線性關系良好。

1.2.2.3 原料溶液的制備

精密稱取干燥枇杷葉粉末5.049 6 g，加入30 mL甲醇超聲3次，每次30 min，合并提取液，過濾，甲醇定容至100 mL容量瓶，搖勻，取上清液，用孔徑為0.45 μm 的微孔濾膜過濾，進樣量20 μL，采用高效液相色譜法分析，得原料中熊果酸含量為1.042%。

1.2.2.4 粗品溶液的制備

精密稱取一定量的熊果酸粗品，甲醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，取上清液，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾，進樣量20 μL，采用高效液相色譜法分析，歸一法測定粗品中熊果酸的含量，并分別計算出各個試驗的提取率。

2 結果與討論

2.1 均勻試驗設計與結果

取20g枇杷葉粉末，乙醇為溶劑，超聲提取。用均勻設計法考察了乙醇體積分數、提取時間、提取次數、液固比以及粒子大小對提取效果的影響。以提取率為試驗評價指標，試驗安排與結果如表1所示。

從表1可以看出，均勻設計試驗的結果沒有整齊可比性，大多數文獻報道試驗結果通常用多因素多水平線性回歸分析或逐步回歸分析的方法來篩選變量，建立定量關系［11］。然而提取率與提取工藝條件之間是一種復雜非線性關系，提取條件間存在交互影響，如果工藝條件多結果分析很難做到科學合理。而人工神經網絡作為人工智能的一種計算工具，能夠有效地考察提取條件間的交互作用，具有強大的處理非線性問題的能力［12］。本文用人工神經網絡技術研究試驗結果、分析系統規律。

表1 均勻設計試驗與結果

2.2 人工神經網絡建模

2.2.1 人工神經網絡模型的建立

對試驗數據采用3層的拓撲結構為5－3－1的誤差反向傳播模型(back-propagation，BP)建立描述熊果酸提取的人工神經網絡辨識模型。網絡輸入層的節點數即為工藝中影響因素的數量，試驗為5個影響因素因此有5個輸入節點。網絡輸出層的節點數是試驗評價指標即提取率指標，亦即優化工藝預報的對象。本工作的輸出節點數為1。為了保證模型的健壯性，本文中隱藏層的節點數經過反復試驗計算，確定其數量為3，此數值較小建立的模型健壯性強。

2.2.2 人工神經網絡模型參數的確定

BP網絡具有學習功能，每次以隨機抽取的8(=10－2)組試驗數據進行訓練，其余2組試驗數據用作測試模型質量，稱為“留二法”(leave-two-out)，在訓練過程中可以根據計算誤差調整權重，當誤差達到10－6時，記錄當前權重值和偏置值，構成模型網絡，訓練次數為29次，訓練誤差見圖1。網絡參數如表2、表3所示。

圖1 網絡模型訓練誤差

表2 隱含層與輸入層的連接權重

表3 輸出層與隱含層的連接權重和偏置

圖2 模型計算值與試驗值比較

2.2.3 人工神經網絡模型的試驗驗證

為了檢驗人工神經網絡建模結果的可靠性，用驗證試驗對人工神經網絡模型進行驗證。

表4 驗證試驗值與計算值比較

表4給出了試驗測定值與神經網絡辨識值。圖2橫坐標為神經網絡辨識值，縱坐標為試驗測定值，各點越接近對角線就說明兩者誤差越小。如圖2所示，訓練預報點和試驗點大部分散落在對角線附近，誤差較小，驗證了人工神經網絡模型系統辨識結果的可靠性。

2.3 提取熊果酸時間特性研究

為了使試驗更加符合實際情況，更快尋找出優化工藝，采用多因素多水平鄰近分析的方法對枇杷葉中熊果酸的提取工藝進行研究，即以均勻試驗的各組參數為基礎，利用已訓練成功的人工神經網絡模型對試驗點附近的參數組合進行較為系統的研究。此種方法高度保持了均勻試驗設計的“均勻”特性，使得研究工藝范圍廣，研究范例具有均勻性、系統性。

由于需要系統研究的工藝范圍廣泛，涉及參數眾多，限于篇幅原因，本文論述的只是不同乙醇體積分數條件下提取時間對產率影響。在相應試驗工藝條件下研究其影響規律，通過神經網絡模型指導安排新的試驗。

2.3.1 試驗1與試驗2鄰近時間影響分析

圖3 液固比7∶1(g∶mL)，提取2次，粒子80目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

圖3 可以看出7條曲線的變化趨勢基本一致，隨著提取時間的延長，熊果酸提取率都為增長的趨勢。不同乙醇體積分數條件下，提取時間的延長對產率影響不同。乙醇體積分數在低濃度65%時，隨著提取時間的延長，產率增加幅度不大，時間延長到95 min時產率達到最大極限值94.98%。同時隨著乙醇體積分數的增大，產率達極限值需要的提取時間在縮短。乙醇體積分數在較低濃度80%時，延長到75 min時產率達到最大極限值95%左右。在試驗1條件下，若提取時間小于60 min，則同一提取時間下，乙醇體積分數越高，熊果酸提取率就越高。從提取時間-產率關系上分析，試驗1工藝時間特性屬于“加速型”，即延長提取時間產率的增長率提高。

圖4 液固比11∶1(g∶mL)，提取3次，粒子大小40目不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

由圖4可見，隨著提取時間的延長產率先減少后增加，減小的速度明顯比增加的速度快，并且增加的幅度很小，產品產率較低。提取時間的延長對低濃度乙醇條件下的產率影響較大。乙醇體積分數為65%時，隨著提取時間的延長產率變化很明顯，提取時間在60 min時產率大于90%，延長時間到90 min時產率10.18%，90 min后提取率緩慢上升。延長時間到90 min以上時乙醇體積分數越高產率越高。從提取時間-產率關系上分析，試驗2工藝時間特性屬于“拋物線型”，即提取時間對產率的影響有極低值。

2.3.2 試驗3與試驗4鄰近時間影響分析

圖5 液固比4∶1(mL∶g)，提取2次，粒子大小40目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

圖5 中曲線變化趨勢基本一致，隨著提取時間的不斷延長，熊果酸的提取率不斷增大。在乙醇體積分數較低的情況下，增加提取時間，產品產率的增加不明顯。這種趨勢在65%乙醇體積分數下提取熊果酸表現的更為明顯，提取時間從60 min變化到110 min時，產率僅為最低極限0.086%。隨著乙醇體積分數的不斷增大，提取時間對產率的影響較為明顯，當乙醇體積分數達到95%時，提取時間延長至80 min以后，提取率快速上升。從提取時間-產率關系上分析，試驗3工藝時間特性屬于“減速型”，即延長提取時間產率的增長率降低。

圖6 液固比8∶1，提取3次，粒子大小20目不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

從圖6可得到同樣的規律:隨著提取時間的延長，熊果酸的提取率不斷增大而且變化幅度比較大。不同乙醇體積分數條件下要得到同樣產率的產品所需提取時間不同。乙醇體積分數為65%時，產率要高于40%至少要提取105 min，乙醇體積分數75%時需要95 min，乙醇體積分數90%時至多需要75 min。從提取時間-產率關系上分析，試驗4工藝時間特性與試驗3相同屬于“減速型”。

2.3.3 試驗5與試驗6鄰近時間影響分析

圖7 液固比12∶1，提取1次，粒子大小20目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

從圖7可見，提取時間的延長對熊果酸提取率的影響不同。乙醇體積分數為65%時，產率隨提取時間的增加而增加。隨著乙醇體積分數的增大，產率隨提取時間的增加幅度不斷減小，最終出現不明顯的提取率降低趨勢。低乙醇體積分數產率增加幅度大，提取時間從60～80 min的20 min內65%乙醇產率提高0.29%/min，85%乙醇產率則提高0.09%/min。從提取時間-產率關系上分析，試驗5工藝時間特性亦屬于“減速型”。

圖8 液固比5∶1，提取3次，粒子大小80目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

圖8 中曲線變化的整體趨勢是延長提取時間有利于提高熊果酸提取率。若要得到產率在90%以上的產品，90%的乙醇中要提取95 min，80%的乙醇中則要提取110 min，當乙醇體積分數降到70%時，提取120 min，僅得到不足85%的產率。從提取時間-產率關系上分析，試驗6工藝時間特性屬于“加速型”。

2.3.4 試驗7與試驗8鄰近時間影響分析

圖9 液固比9∶1，提取1次，粒子大小80目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

圖10 液固比13∶1，提取2次，粒子大小80目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

從圖9可見，延長提取時間并不利于熊果酸提取率的提高。較低乙醇體積分數條件下，產率并沒有隨著提取時間的延長而變化;較高乙醇體積分數條件下，產率隨著提取時間的延長反而在降低，下降的幅度較大。若提取時間從105 min延長到120 min，乙醇體積分數為90%時，產率降低了近40%;乙醇體積分數為85%時，產率降低了近25%。因此，在較低乙醇體積分數條件下，105 min時就能得到高產率的產品。從提取時間-產率關系上分析，試驗7工藝時間特性為“衰減型”，即延長提取時間產率降低較快。

圖10可以看出延長提取時間有利于提高熊果酸提取率。不同乙醇體積分數條件下，延長提取時間對熊果酸提取率影響不同。提取時間為25 min時，乙醇體積分數為65%的提取條件下，產率只有1.10%;乙醇體積分數為80%的產率為38.33%;乙醇體積分數為95%的產率為87.05%;要得到高產率的產品，乙醇體積分數為95%的提取條件下只需延長5 min即得到94.98%的產率，乙醇體積分數為80%的需延長20 min方可得到同產率產品，而乙醇體積分數為65%的則要延長30 min。從提取時間-產率關系上分析，試驗8工藝時間特性屬于“加速型”。

2.3.5 試驗9與試驗10鄰近時間影響分析

圖11 液固比6∶1，提取1次，粒子大小40目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

圖12 液固比10∶1，提取2次，粒子大小20目時不同乙醇體積分數下提取時間對產率的影響

可以看出圖11中曲線的變化與圖4中曲線變化基本一致，隨著提取時間的延長產率先減少后增加，減小的速度明顯比增加的速度快，并且增加的幅度很小，較低乙醇體積分數提取條件下產品產率低于其相應的初始值。提取時間的延長對低濃度乙醇條件下的產率影響較大。乙醇體積分數為65%時，隨著提取時間的延長產率變化很明顯，提取時間在25 min時產率大于90%，延長時間產率降低，達到最低值后，時間的延長有利于產率的提高。從提取時間-產率關系上分析，試驗9工藝時間特性屬于“拋物線型”。

從圖12可見，曲線變化趨勢一致，延長提取時間有利于提高熊果酸的提取率。不同乙醇體積分數條件下，提取時間的延長對熊果酸提取率的影響是不同的。乙醇體積分數較低時，提取率隨時間的延長增加較快;乙醇體積分數較高時，提取率隨提取時間的延長增加緩慢。提取相同的時間，乙醇體積分數越高，熊果酸的提取率就越高。從提取時間-產率關系上分析，試驗10工藝時間特性與試驗3相同屬于“減速型”。

2.3.6 時間影響分析

圖13 對應因子分析時間特性影響工藝分類

采用對應因子分析方法［13］對10個試驗的時間特性進行分析，可以發現其基本規律。對應因子分析坐標 F1=6.321 944×10－2乙醇體積分數(%)+7.569 224×10－2提取時間(min) －7.135 487×10－1液固比(mL/g)+9.362 540×10－2提取次數 +5.111 274×10－2粒子大小(目)+6.882 883 ×10－1提取率(%)

F2=4.270 738×10－2乙醇體積分數(%)－6.612 222×10－1提取時間(min)+3.991 259 ×10－1液固比( mL/g)－3.209 876×10－1提取次數－1.051 221×10－1粒子大小(目)+5.379 590 ×10－1提取率(%)

圖13中A、B、C、D和E分別依次表示乙醇體積分數、提取時間、液固比、提取次數和粒子大小。圖13可見。試驗1、6、8基本屬于一類，其時間特性為“加速型”，即隨著時間推移提取效率增率提高，且相近原因是粒子大小均為80目，導致“加速型”影響關系。試驗3、10相近由于提取時間相近，試驗4、5相近由于乙醇體積分數和液固比原因，這4個試驗呈“減速型”特性，即隨著時間推移提取效率增率降低。試驗2、9劃為一類，呈現“拋物線型”，即隨著時間推移提取效率先降低再升高。7屬于另類，“衰減型”，即隨著時間推移提取效率降低。

3 工藝優化

利用訓練成功的人工神經網絡模型優化了枇杷葉中熊果酸提取工藝參數，結果如表6所示。

以產率高于90%為目標優化，提取時間間隔15 min，在考察各影響因素試驗范圍區間內，共發現307組工藝組合，現列出其中的26組。

表6 產率在91%～99%產品生產工藝部分優化結果(共307組，列出低濃度段26組供參考)

選取表6中的乙醇體積分數為65%，提取時間為15 min，液固比為10，提取次數為2，顆粒目數為40目，做試驗，產率為90.77%(模型計算為91.38%)。

4 結論

采用均勻設計法安排試驗，其特點研究因素多，研究水平數多，有利于系統研究。采用人工神經網絡高度非線性分析技術能夠解決多因素多水平試驗結果建模問題。本文提出的多因素多水平鄰近分析方法將巨大量的試驗結果分析合理簡化，取得了很好的效果。其優化的工藝經過試驗驗證基本一致。

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