烏龍茶與普洱茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制作用

劉艷豐，黃惠華

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州，510640)

茶葉中含有生物堿、茶多酚等生物活性成分，因而茶葉具有抗氧化、抗菌、減肥、降血脂、降血糖、防止動脈硬化和血栓形成等多種保健功能［1］。對各種疾病的具體影響機理尚不明確。淀粉在人體內的轉化是食物消化的重要部分，淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液和胰α-淀粉酶活性，阻礙食物中碳水化合物的分解和消化，減少葡萄糖產生和攝取，降低人體血糖水平，減少糖類向脂肪的轉化，有效預防和改善糖尿病以及肥胖癥等疾病［2］。茶多酚是茶中最重要的功能活性物質，20世紀90年代，日本學者在體外模擬淀粉消化試驗基礎上，通過動物試驗發現兒茶素可以抑制大鼠體內α-淀粉酶和蔗糖酶的活性［3］。另外，張冬英等的研究也表明，普洱茶茶液中的沒食子酸對α-淀粉酶有較強的抑制作用，且普洱茶對α-淀粉酶的抑制效果隨著茶葉貯存年代與產地的不同而各異［4－5］。目前國內外對茶多酚在體外對α-淀粉酶作用機理研究以及發酵程度不同的茶對淀粉酶的抑制作用研究比較缺乏。

本實驗以鐵觀音與黑茶六堡茶的茶提取液為α-淀粉酶抑制劑，以茶浸提液中的固形物含量為表征，通過非連續測定和Dixon作圖分析，探求這2種發酵程度不同茶的茶液對胰α-淀粉酶的抑制動力學特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵觀音，福建省安溪縣豐發茶廠;六堡茶，廣西蒼梧六堡茶葉有限公司;茶多酚，購于福建市場;豬胰α-淀粉酶(porcine pancreas amylase，PPA)，Sigma 公司;可溶性淀粉和麥芽糖等，均為分析純。DNS(3，5-二硝基水楊酸)顯色劑溶液。

pHS22C型pH計，上海雷磁儀器廠;棱光752N型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，浙江臨海市東方儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶溶液的制備

稱取磨碎的2種茶的茶樣各10 g，80 mL水，80℃水浴提取25 min，重復3次，然后4 000 r/min離心20 min，取上清液過濾后加水定容至250 mL。

1.2.2 茶浸提液中固形物與茶多酚含量測定

固形物含量測定:準確量取按1.2.1方法獲得的茶液50 mL到已知重量的燒杯中，經真空冷凍干燥后稱重，經計算，得出茶浸提液中的可溶性固形物總含量。

茶多酚含量測定:福林法［6］。以茶多酚含量表征茶液中的抑制劑含量。

1.2.3 酶活性的測定

采用Bernfeld法測定［7］。酶活性定義:在pH值為7，37℃的條件下，1 min內生成1 μmoL還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。測定酶的活性時，移取0.5 mL胰α-淀粉酶溶液到15 mL試管，37℃恒溫，然后加入37℃預熱的0.5 mL濃度為1%淀粉溶液作為反應底物，37℃反應3 min，加入l mL DNS顯色溶液，混合，沸水浴8 min，放置20 min使其冷卻至室溫，加蒸餾水10 mL稀釋，于540 nm處測定吸光值。以0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液作為空白對照。

1.2.4 兩種茶浸提液對胰α-淀粉酶半抑制濃度的確定

取0.25 mL濃度為0.08 mg/mL的酶液于試管，分別加入0.25 mL稀釋不同倍數后的茶浸提液，混合均勻并置于37℃水浴中預熱。10 min后加入0.5 mL

式中，T1和T2分別代表無抑制劑和有抑制劑時的酶活力。

1.2.5 兩種茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制類型

1.2.5.1 抑制類型(可逆或不可逆)的研究

固定2種茶浸提液的稀釋倍數均為6倍，分別在酶濃度為 0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的條件下，按照1.2.3所示方法測定吸光值，作為加抑制劑的反應組。再以蒸餾水代替2種茶液，作為不添加抑制劑的反應組，以上述各酶濃度進行反應，同樣按1.2.3所示方法測定吸光值，作為未加入抑制劑的反應組，2組都以緩沖液代替酶液，蒸餾水代替茶液在同樣的條件下反應作為空白對照。根據酶活性的變化與浸提液濃度之間的關系判斷抑制類型。

1.2.5.2 可逆性抑制類型的研究

固定酶濃度為0.06 mg/mL，底物淀粉溶液的濃度在0.5%和1%之間變化，加入稀釋倍數分別為4倍，6倍，8倍、10倍的2種茶浸提液，按照1.2.3所示方法測定反應吸光度值，然后通過dixon作圖，得到2條直線，根據獲得的dixon圖判斷2種茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制類型并計算其抑制常數Ki。

1.2.6 兩種茶液對胰α-淀粉酶的光譜性質影響

移取3 mL濃度為0.06 mg/mL的胰α-淀粉酶溶液于石英比色池中，掃描200～300 nm的吸收光譜后，用微量進樣器加入不同體積的同樣稀釋10倍的2種茶提液到含有酶液的比色池中，混勻，放置3～5 min后再次掃描200～300 nm的吸收光譜。移取2 mL濃度分別從0.5 mg/mL至1 mg/mL茶多酚溶液于石英比色池中，掃描200～300 nm的吸收光譜，獲得2種茶液各自在不同濃度下作用于胰α-淀粉酶溶液的紫外吸收差譜。預熱到37℃的1%淀粉溶液。反應3 min立即加1.0 mL DNS顯色劑，混合，沸水浴8 min，冷卻后用10 mL蒸餾水稀釋，540 nm處測定吸光值。另取0.25 mL緩沖溶液替代酶溶液作空白對照，以0.25 mL蒸餾水代替茶提液作無抑制劑的酶活測定，求出抑制效率，進行多元非線性擬合，得回歸方程，求出半抑制濃度。抑制活性計算公式為［8］:

2 結果與討論

2.1 兩種茶浸提液中的固形物與茶多酚含量及對胰α-淀粉酶半抑制濃度

250 mL的鐵觀音與六堡茶茶浸提液中的可溶性固形物含量分別為3.25 g與2.56 g，總茶多酚含量分別為1.17 g與0.74 g，鐵觀音與六堡茶茶液中茶多酚濃度分別為4.69 mg/mL與2.95 mg/mL，即鐵觀音中的茶多酚含量明顯高于六堡茶，這可能與六堡茶的發酵程度比鐵觀音的發酵程度高有關，因為茶多酚在茶的發酵過程中會不斷轉化成茶黃素、茶紅素等物質，且發酵程度越高，茶多酚減少量越大［9］。

圖1 鐵觀音茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制曲線

圖2 六堡茶茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制曲線

圖1 與圖2所示分別為2種茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制效果曲線。在EXCLE中進行多元非線性擬合，得鐵觀音茶茶浸提液抑制曲線回歸方程為:y=－0.007 1x4+0.100 4 x3－0.461 1 x2+0.883 8 x－0.228 7，R2=0.999 7，六堡茶茶浸提液抑制曲線回歸方程為:y=0.000 8x3+0.007 5x2－0.010 6x+0.123 6，R2=0.998 9，2 種茶對胰 α-淀粉酶的半抑制濃度分別為茶浸提液中的固形物濃度為2.88 mg/mL和10.48 mg/mL。

2.2 兩種茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制類型

鐵觀音與六堡茶茶液對胰α-淀粉酶的抑制動力學曲線如圖3、圖4所示。根據抑制劑與酶的作用方式與特點，抑制作用分為可逆抑制與不可逆抑制作用兩種。不可逆抑制作用是通過抑制劑與酶的作用，通過價鍵結合的方式引起酶的失活，又被稱為酶的修飾抑制，可逆抑制作用的抑制劑與酶通過非共價鍵結合，去除抑制劑后酶的活性可以恢回復。當反應體系中有可逆性抑制劑存在時，得到的直線為通過原點，但斜率小于不加入抑制劑組的直線斜率，當體系中存在不可逆抑制劑時，得到的直線不通過原點［10］。因此，由圖3、圖4可推斷鐵觀音與六堡茶茶液對豬胰α-淀粉酶的抑制類型都為可逆抑制作用。

圖3 鐵觀音茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制動力學曲線

圖4 六堡茶茶浸提液對胰α-淀粉酶的抑制動力學曲線

2.3 兩種茶浸提液對胰α-淀粉酶的可逆抑制類型

可逆抑制作用根據可逆抑制劑與底物的關系分為競爭性、非競爭性、反競爭性抑制3種類型。當dixon圖中的直線交點位于橫坐標軸上時，非競爭性可逆抑制，若直線都與橫坐標軸相交但交點不在橫坐標軸上時，為競爭性可逆抑制，若有直線與橫坐標軸平行，且交點不在橫坐標軸上時為競爭性可逆抑制。

因此，由圖5、圖6可推斷出鐵觀音與六堡茶茶液對豬胰α-淀粉酶的可逆性抑制類型都為非競爭性抑制。另由于dixon圖中各直線交點的橫坐標即為抑制劑常數，故計算得知鐵觀音與六堡茶茶液對胰α-淀粉酶的抑制常數分別為茶浸提液中固形物濃度為3.96 mg/mL與13.30 mg/mL。

2.4 兩種茶液與胰α-淀粉酶溶液作用的紫外光譜

圖5 鐵觀音茶浸提液對胰α-淀粉酶的可逆性抑制dixon圖

圖6 六堡茶茶浸提液對胰α-淀粉酶的可逆性抑制dixon圖

胰α-淀粉酶溶液在200～300 nm范圍內具有212 nm處與259 nm處2個較大的吸收峰，由于212 nm處的波譜產生跳躍，影響比較結果，故選定245～275 nm作為考察范圍，研究加入不同固形物總量的兩種茶浸提液與胰α-淀粉酶溶液作用后的紫外吸收差譜，如圖7所示，圖中的曲線1為50 μL稀釋10倍的鐵觀音茶液(固形物總量為65 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液的紫外光譜圖，曲線2為100 μL稀釋10倍的鐵觀音茶液(固形物總量為130 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液的紫外光譜圖，曲線3為60 μL稀釋10倍后的六堡茶茶液(固形物總量為19.2 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液作用的紫外吸收光譜圖，曲線4為80μL稀釋10倍后的六堡茶茶液(固形物總量為25.6 μg)與3 mL胰α-淀粉酶溶液作用的紫外吸收光譜圖。酶在近紫外光區域之的光吸收能力是由分子中的 Trp，Tyr，Phe 等殘基引起［11］，這些基團的微環境改變引起基團的結構變化，進一步影響吸光性質，如環境中劑型的改變會引起吸收峰的藍移或紅移。因此，從圖7可知，在259 nm處，鐵觀音與六堡茶茶浸提液與胰α-淀粉酶溶液作用后的紫外吸收強度隨著各自加入茶液的固形物含量增多而增強，即胰α-淀粉酶的結構變化越大。

3 結論

圖7 兩種茶浸提液與胰α-淀粉酶溶液作用的紫外吸收差示光譜

鐵觀音與六堡茶的茶液對豬胰α-淀粉酶都存在抑制作用，且抑制類型都為非競爭型可逆抑制 ，得鐵觀音茶浸提液對胰α-淀粉酶的半抑制濃度(IC50)為固形物濃度2.88 mg/mL，六堡茶茶浸提液對胰α-淀粉酶的半抑制濃度(IC50)為固形物濃度10.48 mg/mL，即鐵觀音對豬胰α-淀粉酶抑制作用明顯強于六堡茶，得鐵觀音茶浸提液的Ki值為固形物含量3.96 mg/mL，六堡茶茶浸提液的Ki值為固形物含量13.30 mg/mL。紫外吸收差譜結果表明，一定范圍內，2種茶液濃度的增加，使經茶液處理的α-淀粉酶溶液在259 nm處吸收峰增強，但不發生明顯紅移。可作為不同品種的茶對胰α-淀粉酶的機理分析和應用評價。

［1］ 陳宗懋.茶葉內含成分及其保健功效［J］.中國茶業，2009(5):4－5.

［2］ 陳睿，曾陽，黃元，等.灰栒子提取物對α-淀粉酶抑制作用的初步研究［J］.食品科技，2009，34(11):243－245.

［3］ Matsumoto Natsuki，Ishigaki Fumiko，Ishigaki Akiyo，et al.Reduction of blood glucose level by tea catechin［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1993，57(4):525－527.

［4］ 張冬英，邵宛芳，劉仲華，等.普洱茶化學成分及對α-淀粉酶抑制作用的研究［J］.西南農業學報，2009，22(1):52－53.

［5］ 張冬英，余霜，黃業偉，等.普洱茶對α-淀粉酶抑制作用的影響研究［J］.食品工業科技，2009，30(2):77－79.

［6］ 周衛龍，許凌，徐建峰，等.GB/T8313－2008第二法茶葉中茶多酚測定的研究比較［J］.中國茶葉加工，2009(1):40－41.

［7］ B.施特爾巴赫著，錢喜淵譯.酶的測定方法［M］.北京:中國輕工業出版社，1992:37－41.

［8］ 雷芳.茶堿、咖啡因、可可堿對胰a-淀粉酶部分理化性質的影響［D］.成都:四川大學，2006.

［9］ 王霞賴，穗生.幾種茶葉中茶多酚含量的比較［J］.科技資訊，2009，24:212.

［10］ 王鏡巖，朱圣庚，徐長法，等.生物化學［M］.北京:高等教育出版社，2002:170－173.

［11］ 劉雯，裘曉丹，雷芳，等.茶堿對胰α-淀粉酶的抑制類型及光譜性質［J］.天然產物研究與開發，2008，20:298－300.