市售醬油中呈味核苷酸的測定*

楊榮華，金燕，趙華杰，王宏海，戴志遠

(浙江工商大學水產品加工研究所，浙江杭州，310035)

醬油是一種由多種微生物對蛋白質和淀粉質原料進行分解發酵后得到的調味產品，具有獨特和復雜的香氣成分以及各種滋味。它是中國等亞洲國家的傳統調味品，具有色、香、味俱佳的特點，一直以來深受人們喜愛。隨著食品技術的發展，添加劑的使用日益普遍，呈味核苷酸作為一種新型的食品添加劑，已逐漸廣泛應用于食品調味中。如今不少醬油生產廠商將一些呈味核苷酸作為增鮮劑添加到醬油中，以改善其呈味品質。

呈味核苷酸主要包括5＇-肌苷酸二鈉鹽(以下簡稱為IMP)和5＇-鳥苷酸二鈉鹽(以下簡稱為GMP)，這兩者以一定比例直接添加到醬油中，能增加醬油濃厚風味及提高鮮度。國外(尤其是日本)研究者對醬油類調味品中的呈味核苷酸分析得較為全面，除了IMP、GMP這2種對鮮味貢獻最大的核苷酸外，還對其它核苷酸，如ATP(三磷酸腺苷)、ADP(二磷酸腺苷)、AMP(磷酸腺苷)、Hx(次黃嘌呤)及 HxR(次黃嘌呤核苷)等進行了分析，大量的實驗結果表明，在醬油中一般不含ATP、ADP、AMP及HxR，而Hx在大多數產品中均有測得［1－3］;國內亦曾有關于醬油中呈味核苷酸的報道，但僅對IMP和GMP進行了分析，且所得圖譜中兩者分離效果不是十分理想［4］。

為了較為全面地分析醬油中的核苷酸，并獲得較好的分離效果，本文結合國內外研究的成果，對5種市售醬油中3種主要核苷酸類物質(IMP、GMP、Hx)進行液相色譜分析。另外，筆者還結合醬油的基本成分分析及鮮味感官評價結果，對呈味核苷酸的添加對于醬油產品品質和其市場價值的影響作了粗略的探討。

1 實驗部分

1.1 儀器及儀器條件

儀器:Alliance 2695型高效液相色譜儀(Waters公司，配有2996紫外可見光檢測器)。

液相色譜條件:色譜柱為Waters SunfireTMC18色譜柱，250 mm ×4.6 mm I.D.，粒徑 5 μm;流動相為0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH值=4.6)，等梯度洗脫;運行時間為14 min;流速1.0 mL/min;柱溫為30℃;檢測波長 254 nm;進樣量 10 μL。

1.2 試劑及材料

甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，IMP、GMP及Hx均為色譜純產品(購于BBI公司)。

5種待測醬油樣品:購于物美超市杭州文一店，以下分別稱為醬油樣品Ⅰ～Ⅴ。產品基本信息詳見表1。

1.3 樣品預處理

核苷酸混合標準樣品:分別稱取IMP、GMP和Hx 0.1 000 g、0.100 0 g和0.050 0 g(Hx水溶性較差，故用量較少)加水溶解后定容至100 mL，所得溶液濃度為1 000 mg/L混標(Hx為500 mg/L，以下不再重復說明);其它濃度的混標在此基礎上逐步稀釋得到。

待測樣品預處理:準確吸取5 mL醬油樣品于50 mL容量瓶中，用75%甲醇溶液定容至50 mL，搖勻靜置30 min后，取適量于5 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min(無高速離心設備時，可以通過適當延長離心時間來達到相同的效果)，取上清液2 mL稀釋至10 mL，過0.45 μm濾膜后，進樣測定。此過程原液被稀釋了50倍，若稀釋倍數過高或過低使得所得結果不在標準曲線范圍內時，可通過改變上清液的稀釋倍數來調整，但稀釋倍數不能低于3倍，以防止樣品溶劑過分強于流動相，而出現峰形不規則現象。

表1 5種醬油產品的基本信息

加標回收樣品預處理:準確吸取4.0 mL醬油樣品和1.0 mL 1 000 mg/L核苷酸混合標準樣品，混合后，用75%甲醇溶液定容至50 mL，以下操作同待測樣品的預處理。

1.4 醬油基本成分的測定［5］

NaCl的測定:沉淀滴定法;氨基態氮的測定:甲醛滴定法;總氮的測定:微量凱氏定氮法;總酸的測定:電位滴定法。

1.5 醬油鮮度感官評價

參考舩津保浩等人［6］對マルソウダ魚醬油感官評價的方法，對樣品進行5級強度標度的感官評定，從1～5鮮度感覺逐漸增強。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

本文在確立1.1所述色譜條件前，就流動相的pH值、柱溫及流速對3種標樣分離度的影響作了探討。實驗表明，GMP峰和IMP峰的分離是本分析的難點，其中流動相pH對兩者分離度的影響最大，當pH在7.0左右時，GMP和IMP的色譜峰幾乎重疊在一起，隨著流動相pH的下降，兩者分離度逐漸提高。本文通過改變流動相中K2HPO4和KH2PO4的濃度配比來調節流動相pH，流動相中KH2PO4的比例愈高，pH愈低，最終發現，當采用0.05mol/L KH2PO4溶液作為流動相(pH值=4.6)時，GMP和IMP得到了較好的分離。另外，柱溫和流速主要影響的是出峰時間和柱壓，對分離度的影響不大。最終確定HPLC條件為:以0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH值=4.6)作為流動相，等梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長254 nm。此條件下測得10 mg/L混標和醬油樣品Ⅱ的HPLC圖譜，如圖1和圖2所示(進樣量 10 μL)。

圖1 10 mg/L核苷酸混合標準樣品HPLC圖譜

圖2 醬油樣品ⅡHPLC圖譜

2.2 方法準確性分析

對5種市售醬油樣品及加標回收試驗的分析結果進行外標法定量，并計算回收率，結果如表2所示。由表2可知，5種試樣中GMP、IMP和Hx的平均回收率分別為100.1%、101.3%和99.6%。

2.3 方法的精密度

取IMP、GMP和Hx含量分別為10 mg/L、10 mg/L和5 mg/L的混合標準樣品，按所選擇的條件重復測定5次，結果見表3。由表3結果可知，在上述濃度下，各樣品測定的變異系數均小于1%，具有較好的精密度。

表2 實驗方法的準確度

表3 實驗方法的精密度

2.4 方法的線性

鑒于醬油樣品中呈味核苷酸的含量一般為0～1 000 mg/L［1－2，4］，樣品預處理時總稀釋倍數為 50，故在制作標準曲線時，選擇的5個濃度梯度分別為1，5，10，15，20 和 25 mg/L，以核苷酸的濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標制作標準曲線，并計算回歸方程分別為 y=15 213x－2 821.9(R2=0.999 1)、y=17 395x－2 887.8(R2=0.999 4)和y=44 122x－1 464.8(R2=0.999 9)，可見GMP、IMP濃度在1～25 mg/L，Hx濃度在0.5～12.5 mg/L時，與峰面積呈良好的線形關系。

2.5 樣品測定結果及分析

5種市售醬油中核苷酸的測定結果、基本成分分析結果、鮮度感官評價結果分別如表4、表5和表6所示。

表4 5種市售醬油中核苷酸測定結果 mg/L

表5 5種市售醬油中基本成分分析結果 mg/100 mL

表6 5種醬油產品鮮度感官評價結果

IMP、GMP 對鮮味有較大的增強作用［7－8］，而 Hx呈苦味［9］。一般認為，純天然釀造醬油中不含IMP和GMP，而Hx則來源于ATP代謝的最終產物［10］，因此根據測定結果可以認為醬油樣品Ⅲ和Ⅴ未添加呈味核苷酸，而其它3種醬油中可能添加了相應的呈味核苷酸，這與產品標簽上的標注相符合。結合鮮度感官評價結果可知，添加呈味核苷酸對提高產品鮮味效果明顯。醬油樣品Ⅲ和Ⅴ的鮮度相對較低，但市售價格卻相對最高，這就說明了鮮度不是衡量調味品品質的最重要指標，在保證產品調味功能的前提下，產品的天然性對于其市場影響力有著重要作用。另外，結合基本成分的分析結果，醬油樣品Ⅴ的氨基態氮含量是醬油樣品Ⅰ和Ⅱ的2.5倍左右，也遠高于醬油樣品Ⅲ和Ⅳ，這與其以魚為原料進行發酵生產有關，同時由于此類產品中富含各種活性成分(如牛磺酸等)［11］，使得該產品的市場價格頗高;醬油樣品Ⅳ為調配型醬油類產品，其氨基態氮含量次于醬油樣品Ⅴ，但由于其主體原料貝類濃縮汁富含天然活性成分(如牛磺酸、不飽和脂肪酸等)［12］，一定程度上提升了其市場價值，使得價格也在醬油樣品Ⅰ和Ⅱ之上。

3 結論

醬油是調味品市場中最具前景和競爭力的產品之一，呈味核苷酸對于提高醬油產品的鮮味具有明顯的效果，其添加使用將伴隨著醬油行業的發展而存在一段較長的時間。研究主要得出以下結論:

(1)醬油樣品經75%甲醇水溶液脫蛋白預處理，采用反相高效液相色譜法，在以0.05mol/L KH2PO4溶液為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm的條件下，測定醬油中的呈味核苷酸，待測物質分離效果好，分析結果準確度，精密度高。

(2)通過對市售醬油產品中呈味核苷酸的分析，各產品中呈味核苷酸的測定結果與產品標簽說明相符。結合感官評價結果，呈味核苷酸含量與產品鮮度相關性明顯，但通過比較產品價格發現，鮮度不是構成高檔醬油產品市場價值的最重要因素，來源于天然發酵的鮮味、氨基態氮的含量以及功能性成分共同影響著產品的市場價值，這在今后的醬油產品開發中應當引起重視。

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