抗氧化肉品發酵劑乳酸菌的篩選及特性*

劉書亮，王燚，葉勁松，楊勇，陳荀，廖哲

1(四川農業大學食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川北牧南江黃羊集團有限公司，四川 南江縣，636600)

肉品發酵劑中優勢菌群——乳酸菌的存在，保障了發酵肉制品的食用安全性，而葡萄球菌對產品的最終顏色和風味形成起到較大的作用［1］。為了獲得優良的菌種作為肉品發酵劑，國內外學者進行了較多的研究。Miralles［2］、Aymerich［3］等對西班牙發酵香腸，Coppola R［4］、Parente［5］等對意大利傳統發酵香腸，Papamanoli［6］對希臘自然發酵香腸，Fontana［7］對阿根廷發酵干香腸等進行了香腸菌相研究并獲得一些肉品發酵劑菌種。近年來，國內較多研究者對我國傳統發酵肉制品菌相進行初步研究和(/或)獲得了肉品發酵劑的一些候選菌株［8－12］。最近，有報道顯示，某些乳酸菌具有一定抗氧化活性［13－16］。腌臘肉制品的氧化酸敗是其變質的主要原因之一，添加抗氧化劑可一定程度地抑制肉制品的脂肪氧化［17］。若能獲得具有抗氧化能力的肉品發酵劑乳酸菌將是解決肉品氧化變質的另一條有效途徑，但目前關于抗氧化肉品發酵劑乳酸菌的篩選尚鮮見報道。本實驗以四川傳統腌臘肉制品中的乳酸菌為篩選菌源，按照肉品發酵劑要求初篩，再以其抗氧化能力為復篩指標，獲得具有較強抗氧化能力的菌株，研究其生物學特性和進行菌種鑒定，為功能性肉品發酵劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

乳酸菌58株，分離于四川傳統腌臘肉制品;木糖葡萄球菌S02(Staphylococcus xylosus S02)分離于四川臘肉，由四川農業大學食品學院食品微生物實驗室保存。

1.1.2 培養基

改良MRS固體(液體)、MSA、MSM培養基，系列篩選培養基(耐鹽、耐亞硝酸鹽、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原、產氨、產H2S和產氣等試驗);各種生化鑒定培養基(各種糖(醇)類發酵培養基，七葉靈水解、淀粉水解、甲基紅(M.R)、V-P、吲哚和明膠液化等試驗的培養基)［18］。

1.1.3 主要藥品試劑

2× long Taq PCR MasterMix、DNA MakerⅢ購自北京天為時代科技有限公司;Bacterial DNA out抽提試劑盒購自四川綿陽天澤基因工程有限公司;16S rDNA的 PCR擴增引物(上游引物3'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5';下游引物 3'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-5')由上海 invitrogen公司合成;二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)購自Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1.1.4 實驗動物

昆明種小白鼠及飼料購自四川簡陽簡城比爾動物養殖場，合格證號:SCXC(川)2004－15。

1.2 方法

1.2.1 肉品發酵劑乳酸菌初篩

將待測乳酸菌進行耐鹽、耐亞硝酸鹽、接觸酶、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原酶、產氨、產H2S、產氣和產黏液試驗［18］，確定是否符合肉品發酵劑的要求。

1.2.2 抗氧化肉品發酵劑乳酸菌復篩

1.2.2.1 乳酸菌清除羥自由基(·OH)的測定

按照張江巍［19］的方法制備乳酸菌無細胞提取物;按照劉駿［20］的方法測定乳酸菌發酵上清液和無細胞提取物對·OH的清除率。

1.2.2.2 乳酸菌清除DPPH·的測定

參照 Singh［21］、Lin［16］等方法(略有改進)。取樣液0.3 mL于比色管中，加入無水乙醇至3 mL，再加入0.1 mmol/L DPPH·試劑1 mL，強烈振蕩后避光室溫靜止30min，以溶劑調0點，用1 mL比色皿于517 nm處分別測定各反應液的吸光值Ai。同時，測定溶劑和DPPH·試劑的吸光度Ac，樣液和溶劑的吸光度Aj。平行測定3次。按下式計算:

1.2.3 抗氧化乳酸菌菌株的生物學特性

1.2.3.1 菌株生長曲線的測定

將篩選出的乳酸菌接種于MRS液體培養基中，30℃培養72 h，每隔2 h測定其OD600和pH值。同時以空白MRS作對照。

1.2.3.2 菌株在不同溫度下的生長情況

1.2.3.3 菌株間的拮抗試驗

將乳酸菌LS85對木糖葡萄球菌S02做拮抗試驗。按接種量1%(菌液濃度為1.5×107CFU/mL)接種于MSM培養基中，30℃混合培養72 h，每12 h測定pH值及乳酸菌數和葡萄球菌數。乳酸菌數和葡萄球菌數分別采用改良MRS和MSA選擇性培養基進行稀釋平板計數法測定。

1.2.3.4 菌株活菌液的急性毒性試驗

乳酸菌LS85的24 h培養液經5 000 r/min離心20 min，收集菌體，用無菌生理鹽水調節菌數至1.5×108CFU/mL。取昆明種小白鼠20只，按照隨機分組原則分為2組，每組10只，雌雄各半。試驗組按0.2 mL/10 g BW，將乳酸菌LS85的活菌液經口灌胃給小鼠;對照組給予相同劑量生理鹽水。實驗前禁食過夜，但保證正常飲水。灌胃后恢復正常飲食。試驗期限為15 d。每天觀察記錄小鼠飲水、進食、活動及死亡情況。

1.2.4 菌株的鑒定

參照文獻［18］，通過形態學、生化指標及分子遺傳學(16S rDNA)鑒定LS85菌株，確定其種屬分類地位。

2 結果與分析

2.1 肉品發酵劑乳酸菌的初篩情況

按照肉品發酵劑篩選標準，源于四川傳統腌臘肉制品中的58株乳酸菌的初篩結果表明，符合耐6%食鹽、耐100 mg/L亞硝鹽以及接觸酶、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原酶、產氨、產H2S、產氣和產黏液試驗均為陰性的菌株僅有8株，符合率為13.8%(8/58)。

2.2 抗氧化肉品發酵劑乳酸菌的復篩情況

先后以清除·OH能力和DPPH·為抗氧化能力的篩選指標對符合肉品發酵劑篩選標準的8株乳酸菌進行了復篩。8株乳酸菌發酵上清液和胞內提取物對·OH的清除能力(見圖1)。

圖1 乳酸菌對·OH的清除能力

由圖1知，乳酸菌LS85發酵上清液對·OH的清除能力最強，而乳酸菌S21－4胞內提取物對·OH的清除能力最強。除C21－5和C21－7外，其余菌株發酵上清液和胞內提取物對·OH清除能力的差異不明顯。

2013年，水文局認真學習貫徹黨的十八大及十八屆三中全會精神，扎實開展黨的群眾路線教育實踐活動，緊密圍繞水利中心工作，積極踐行“大水文”發展理念，切實推進水文行業管理和各項業務工作，特別是在做好服務防汛抗旱減災和水資源管理等方面取得了一些成效，主要包括以下幾個方面：

選取LS85和S21－4進行了DPPH·清除率的測定，結果見圖2。

圖2 乳酸菌對DPPH·的清除能力

由圖2可知，LS85發酵上清液對DPPH·清除率明顯高于S21－4，二者的無細胞提取物對DPPH·清除率無明顯差異。綜合考慮其抗氧化的能力，最后選擇LS85菌株進行生物學特性研究。

2.3 抗氧化乳酸菌菌株LS85的生物學特性

2.3.1 菌株LS85的生長曲線

乳酸菌LS85培養72 h的生長曲線和pH值變化情況見圖3。由圖3可知，乳酸菌LS85在0～2 h為遲緩期，從第2 h起進入對數期生長，在第32 h時菌體密度達到最大值，此后菌株生長進入穩定期，其培養液pH值在24 h內由pH6.58降至pH3.88，以后進入動態平衡。

圖3 乳酸菌LS85培養72h的生長曲線和pH值變化

圖4 乳酸菌LS85在不同溫度下的生長情況

2.3.2 菌株LS85在不同溫度下的生長情況

菌株LS85在不同溫度下的生長情況見圖4。由圖4知，該菌能在15～40℃內生長，只是在15℃和20℃時，生長緩慢，而在 25、30、35、40℃ 下生長速度較快，差異不明顯。具有較寬的生長溫度范圍。

2.3.3 菌株間的拮抗試驗

乳酸菌LS85與木糖葡萄球菌S02的拮抗試驗結果見圖5。由圖5可知，LS85+S02組可以共同生長，相互間沒有影響，即無拮抗作用。

圖5 乳酸菌LS85和葡萄球菌S02在模擬肉湯中混合培養時的相互關系

2.3.4 菌株LS85活菌液的急性毒性試驗

以小白鼠為試驗對象，對乳酸菌LS85的活菌液進行的急性毒性試驗表明，在15 d飼喂期內，試驗組和對照組小白鼠生長良好，進食正常，未見中毒死亡，解剖未見異常。雌、雄小鼠經口LD50均大于15 000 mg/kgBW。根據GB15193.3－1994《食品安全性毒理學評價程序和方法》中急性毒性的分級標準，乳酸菌LS85的活菌液屬于實際無毒。

2.4 乳酸菌LS85的系統鑒定

2.4.1 乳酸菌LS85的形態學特征

乳酸菌LS85在MRS平板上的菌落特征:直徑約1.5 mm、圓形、凸起度中等、邊緣整齊、表面光滑、乳白色、不透明。革蘭氏染色鏡檢觀察為G+桿菌，短鏈或成排排列，大小為(1.1～1.2)μm×(2.0～2.3)μm，無芽孢、無鞭毛，無莢膜。

2.4.2 乳酸菌LS85的生化鑒定

乳酸菌LS85的生化鑒定結果見表1。由于其接觸酶陰性，發酵葡萄糖產酸，無運動性，不產 H2S，15℃能生長，確定為乳桿菌屬(Lactobacillus)。結合形態學指標，由表1可知，對照文獻［18］，初步將菌株鑒定為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus LS85)。

表1 乳桿菌LS85的生化鑒定結果

2.4.3 乳酸菌LS85的分子遺傳學鑒定

以乳酸菌LS85的總DNA為模板，采用通用引物進行擴增，得到一條長度約1.5kb的特異性擴增產物。并將PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序，測序片斷長1450bp，具有典型的16S rDNA的特征。該序列在GenBank上的登陸號為EU693522。經http://www.ncbi.nlm.nlh.gov網站中使用 BLASTN 2.2.15在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進行同源性搜索，比對結果表明乳酸菌LS85與登錄號EU483102.1、EU483101.1、AB362758.1 等10株戊糖乳桿菌的同源性為100%。結合形態、生化鑒定及16S rDNA比對結果表明乳酸菌LS85為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosusLS85)。

3 討論

3.1 肉品發酵劑乳酸菌的篩選

目前，國內外對肉品發酵劑乳酸菌篩選的報道很多，但多為直接將已知菌種按照篩選標準進行篩選。從傳統發酵肉制品中分離乳酸菌菌株，再按照肉品發酵劑篩選標準進行篩選與鑒定的報道較少。Papamanoli［6］、Fontana［7］、Aymerich［3］、Drosinos［22］從發酵香腸中分離出清酒乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、干酪乳桿菌(L.pentosus)、彎曲乳桿菌(L.pentosus)、植物乳桿菌(L.pentosus)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)等優勢乳酸菌。國內一些學者［8－12］從自然發酵肉制品中分離鑒定出清酒乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌(L.pentosus)、干酪乳桿菌、食品乳桿菌(L.pentosus)等［8－12］，適宜作肉品發酵劑。本文從四川傳統腌臘肉制品中的58株乳酸菌初步篩選出8株適宜為肉品發酵劑菌株，再以清除·OH和DPPH·的能力復篩，得到1株具有抗氧化能力的戊糖乳桿菌。該菌株生長溫度范圍較廣，對木糖葡萄球菌沒有拮抗作用，小鼠急性毒性試驗表明其為實際無毒，可用于功能性肉品發酵劑的開發。

3.2 乳酸菌的抗氧化能力

目前國外對乳酸菌抗氧化能力的研究較多。如Lee等［13］報道了干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)具有螯合金屬離子效應、Lin等［16］報道了嗜酸乳桿菌(L.acidophfilus)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)具有抗脂質過氧化和消除·OH的能力。而國內張江巍等分別探討了乳酸菌［19］和發酵乳［15］抗氧化能力;張鳳敏等［23］篩選到具有抗氧化能力的植物乳桿菌;張書文等［24］研究了2株乳酸菌對活性氧的耐受性。本試驗對8株乳酸菌消除·OH能力的結果表明所有的乳酸菌都具有一定的抗氧化能力，與文獻［19］報道的結果相一致，最終篩選到1株具有較強抗氧化能力的戊糖乳桿菌(L.pentosus)。其發酵上清液和胞內提取物對·OH的清除率分別為88.67%和75.6%;對DPPH·的清除率分別為46.3%和28.6%。目前具有抗氧化能力的乳酸菌主要有:嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、清酒乳桿菌、發酵乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌等［13－16］，但還沒有關于從傳統肉制品中篩選到具有較強抗氧化能力的戊糖乳桿菌的報道，這對功能性肉品發酵劑的研發具有重要的理論意義與應用價值。

4 結論

本文通過待測乳酸菌的耐鹽、耐亞硝酸鹽、接觸酶、氨基酸脫羧酶、硝酸鹽還原酶、產氨、產H2S、產氣和產粘液試驗等指標符合肉品發酵劑標準后，再以對·OH、DPPH·清除率為抗氧化指標，并對篩得的菌株進行急性毒性試驗評價和細菌學系統鑒定，獲得了1株安全而有抗氧化性能的肉品發酵劑戊糖乳桿菌。研究結果對于改進發酵肉制品的品質和安全性具有重要意義。

［1］ Hugas M，Monfort J M.Bacterial starter cultures for meat fermentation［J］.Food Chemistry，1997，59(4):547 －554.

［2］ Miralles M C，Flores J，Perez Martinez G.Biochemical tests for the selection ofStaphylococcusstrains as potential meat starter cultures［J］.Food Microbiology，1996，13(3):227－236.

［3］ Aymerich T，Martin B，Garriga M，et al.Safety properties and molecular strain typing of lactic acid bacteria from slightly fermented sausages［J］.Journal of Applied Microbiology，2006，100(1):43 －49.

［4］ Coppola R，Giagnaeovo B，Iorizzo M，et a1.Characterization of lactobacilli involved in the ripening of soppressata molisana，a typical southern Italy fermented sausage［J］.Food Microbiology，1998，15(3):347 －353.

［5］ Parente E，Grieco S，Crudele M A ，et al.Phenotypic diversity of lactic acid bacteria isolated from fermented sausages produced in Basilicata(Southern Italy) ［J］.Journal of Applied Microbiology，2001，90(6):943－952.

［6］ Papamanoli E，Tzanetakis N，Litopoulou.Tzanetaki E，et al.Characterization of lactic acid bacteria isolated from a Greek dry-fermented sausage in respect of their technological and probiotic properties［J］.Meat Science，2003，65(2):859－867.

［7］ Fontana C，Cocconcelli P S，Vignolo G.Monitoring the bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean sausages［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，103(2):131 －142.

［8］ 羅欣，王海燕，張春江，等.發酵香腸中的菌種分離及鑒定［J］.食品與發酵工業，2003，29(3):5－9.

［9］ 呂兵，張國農.分離自傳統臘腸中的乳酸菌的特性研究［J］.食品與發酵工業，2004，30(8):64 －67.

［10］ 王永霞，牛天貴，郝華昆.肉品發酵劑葡萄球菌和微球菌的篩選［J］.食品與發酵工業，2004，30(9):5－10.

［11］ 李宗軍.中國傳統酸肉中葡萄球菌的分離鑒定與應用研究［J］.生物技術通報，2006，3:77－80.

［12］ 劉書亮，敖靈，李燮昕，等.傳統腌臘肉制品中乳酸菌的分離和鑒定［J］.食品與機械，2007，23(5):14－16.

［13］ Lee J，Hwang K，Chung M Y，et al.Resistance of Lactobacillus casei KCTC 3260 to reactive oxygen species(ROS):Role for a metal ion chelating effect［J］.Journal of Food Science，2005，70(8):388 －391.

［14］ Lin M Y ，C L Yen.Reactive oxygen species and lipid peroxidation product scavenging ability of yogurt organism［J］.Journal of Dairy Science，1999，82(8):1 629 －1 634.

［15］ 張江巍，曹郁生，劉曉華，等.抗氧化乳酸菌L4的SOD活性及其發酵乳的抗氧化作用［J］.中國乳品工業，2006，34(11):12－15.

［16］ Lin M Y，Chang F Y.Antioxidative efect of intestinal bacteria Bifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus ATCC4356［J］.Digestive Diseases and Sciences，2000，45(8):1617 －1622.

［17］ Renata T N，Lireny A G G，Maria Aparecida A P D S，et al.Oxidative stability of fermented goat meat sausage with different levels of natural antioxidant［J］.Meat Science，2003，63(1):43－49.

［18］ 凌代文，東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及試驗方法［M］.北京:中國輕工業出版社，1999

［19］ 張江巍，曹郁生，李海星，等.乳酸菌抗氧化活性及檢測方法［J］.中國乳品工業，2005，33(9):53－56.

［20］ 劉駿.結晶紫分光光度法測定Fenton反應產生的羥自由基［J］.武漢工業學院學報，2005，24(2):53－55.

［21］ Singh R P，Chidambara Murthy K N，Jayap rkasha G K.Studies on the antioxidant activity of pomegranate peel and seed extracts using in vitro models［J］.Journal of Agricultural＆ Food Chemistry，2002，50(1):81 －86.

［22］ Drosinos E H，Mataragas M，Xiraphi N，et al.Characterization of the microbial flora from a traditional Greek fermented sausage［J］.Meat Science，2005，69(2):310－312.

［23］ 張鳳敏，田豐偉，陳衛等.具抗氧化活性乳酸菌的篩選［J］.中國乳品工業，2007，35(2):4－7.

［24］ 張書文，呂加平，孟和畢力格，等.兩株乳酸桿菌 SY13和LJJ對活性氧的耐受性［J］.微生物學報，2009，49(2):119－124.